氨态氮对菲律宾蛤仔毒理机制研究的内参基因筛选

曹滕飞，丛明，李兆艳，赵建民，吕家森，李成华

1. 宁波大学海洋学院，宁波 3152112. 中国科学院烟台海岸带研究所，烟台 2640033. 烟台大学生命学院，烟台 264005

氨态氮对菲律宾蛤仔毒理机制研究的内参基因筛选

曹滕飞1，丛明2,，李兆艳3，赵建民2，吕家森3，李成华1

1. 宁波大学海洋学院，宁波 3152112. 中国科学院烟台海岸带研究所，烟台 2640033. 烟台大学生命学院，烟台 264005

为了准确和系统地分析NH3-N对菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)毒性的分子机制，并对相关基因的转录组学数据进行验证，利用geNorm和Normfinder这2种软件，以暴露30 d中不同时间点的鳃组织cDNA为模板，从18S rRNA (18S)、beta-actin (Actin)、beta-tubulin (Tubu)、elongation factor 1-alpha (EF1α)、cyclophilin A (CyPA)、Ubiquitin (Ub)等6个备选管家基因中，筛选可以稳定表达的内参基因，作为转录组学分析的内参基因。以稀释50倍的鳃组织cDNA模板作为检测模板，geNorm软件分析获得6对备选内参基因的表达稳定性依次为：EF1α>CyPA>Actin>Tubu>Ub>18S，较优内参为EF1α和CyPA；NormFinder软件分析获得6对备选内参基因的表达稳定性为：EF1α>Actin>Tubu>CyPA>Ub>18S，最优内参基因为EF1α。为了验证上述筛选结果，分别以EF1α和CyPA作为内参基因研究unigene1的表达趋势，发现以EF1α为内参基因时，unigene1的qRT-PCR的表达趋势与其转录组表达倍数的变化趋势一致。因此确定NH3-N暴露菲律宾蛤仔后，鳃组织中表达最为稳定的内参基因为EF1α。

氨氮；菲律宾蛤仔；内参基因

海岸带是人类聚居的主要地带之一，工业相对发达，人口也比较密集，工业和生活废物给近岸海洋环境带来很大的生态污染压力。2010—2015年“中国近岸海域环境质量公报”公布的数据显示，我国近岸局部海域海水环境污染情况比较严峻，无机氮一直都是首要的超标因子，而近岸海水中超过Ⅲ类标准限值的无机氮主要是氨氮[1-3]。2010年入海河流水质和污染物入海状况显示，氨氮超标率达到35.0%，氨氮平均浓度为1.82 mg·L-1[1]。“十二五”计划已将氨氮列入减排的约束性指标，其污染状况有所缓解，2011年入海河流的氨氮平均浓度下降到0.274 mg·L-1[2]。但是从2014和2015年的海洋环境质量状况看，氨氮依然是自北向南很多海域包括海水重点养殖区的重要污染因子[3-4]。近岸海域是海洋养殖产业的黄金区域，氨氮污染也因而成为制约我国近岸海水养殖业(包括滩涂贝类养殖业)健康发展的主要污染因子。

国内对于氨氮的贝类生态毒理研究主要集中于传统生态毒理学方面，包括氨氮污染物对贝类的致死率和生理生化反应等。王文琪等[5]对菲律宾蛤仔进行氨氮的急性毒性实验，发现氨氮暴露24 h的半致死浓度为239.88 mg·L-1，氨氮污染对血淋巴细胞的数目和溶菌活力有显著性影响。方军等[6]发现毛蚶(Scapharca subcrenata)稚贝对氨氮具有较高的耐受性，在24 h、48 h、72 h、96 h的半致死浓度分别为96.33、74.16、43.63、20.36 mg·L-1，安全浓度为2.04 mg·L-1，氨氮浓度越高存活率越低；陈金凤等[7]对文蛤的存活率和能量收支情况进行研究，发现总氨氮对文蛤的安全浓度范围为2 mg·L-1，氨氮污染对文蛤的摄食能、呼吸能和排泄能都有影响。罗杰等[8]发现盐度和pH值可以显著影响氨氮对管角螺(Hemifusus tuba)的毒性，盐度越低、pH值越高其毒性越强。Wang等[9]以20.0 mg·L-1的氨氮染毒栉孔扇贝(Chlamys farreri)24 h，导致栉孔扇贝死亡率显著上升，过氧根离子和丙二醛含量也显著上升，谷氨酰胺合成酶活性在暴露后12 d显著上升。国外也有一些关于氨氮污染对养殖贝类危害的研究报道。Reddy-Lopata等[10]发现南非鲍鱼(Haliotis midae)对氨氮的耐受性随体重的增加而增强，长期暴露于亚致死量氨氮浓度下的鲍鱼幼苗的生长率比未接触氨氮的鲍鱼幼苗减少超过50%；Keppler[11]以美洲牡蛎(Crassostrea virginica)为研究对象，发现氨氮浓度升高可以导致牡蛎消化腺和鳃组织细胞的溶酶体不稳定性显著升高，同时谷胱甘肽浓度显著下降。总之，目前大多数氨氮污染的研究集中于传统毒理学的研究，氨氮毒性的分子机理研究较少。

本研究利用菲律宾蛤仔作为研究对象，采用环境污染相关浓度的氨态氮对菲律宾蛤仔进行短期(1 d)和长期(30 d)暴露，以期利用转录组学深入研究NH3-N污染对贝类短期和长期毒性的分子机制。转录组学(Transcriptome)是一门在整体水平上研究细胞中基因转录情况及转录调控规律的学科，也是最早发展起来并得到广泛应用的组学技术[11]。细胞的功能从基因的转录开始，通过分析转录组，可高通量地获得基因表达的RNA信息，揭示基因表达与一些生命现象之间的内在联系。目前，转录组学技术在海洋贝类毒理学领域已得到初步的应用。Milan等[12]采集有机污染严重海域的菲律宾蛤仔，利用转录组学技术对其肝胰腺和鳃中RNA进行测序和归类分析，从中获得了很多与有机污染相关的基因信息。迄今，还未发现利用转录组学技术系统地研究氨氮污染对贝类的毒理学效应的报道。

根据氨氮的致毒途径可知，氨氮主要通过水生动物的鳃组织进入体内，引起生理调节机制紊乱，即鳃是氨氮攻击的第一靶组织[12-15]。因此，本文以菲律宾蛤仔的鳃组织作为研究对象，选取菲律宾蛤仔体内6个表达较为稳定的基因，包括核糖体(18S rRNA)、肌动蛋白基因(beta-actin)、微管蛋白基因(beta-tubulin)、转录延伸因子基因(elongation factor 1-alpha)、亲环素基因(cyclophilin A)、泛素蛋白基因(Ubiquitin)等[16-18]，作为研究氨氮暴露菲律宾蛤仔的转录组学的候选内参基因。利用内参筛选软件geNorm[19]和NormFinder[20]，对这些内参基因在氨氮暴露条件下的表达稳定性进行研究，以期为菲律宾蛤仔鳃组织的转录组学研究筛选稳定表达的内参基因。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 材料

本实验所用菲律宾蛤仔于2014年11月购于烟台市莱山区佳世客超市，选取大小适宜、健康无病、生命力强、体态均匀(11±1.5) g的个体。实验开始前，将蛤仔放入室内进行10 d暂养，暂养期间海水温度(20±2.0) ℃，pH 8.0±0.1，盐度30.0‰，全天曝气供氧，每日定时换水(30个体/30 L过滤海水)、喂食(螺旋藻液)一次。

实验所用氨态氮源为分析纯NH4Cl(国药集团化学试剂有限公司，上海)，配制1 mol·L-1母液100 mL。根据《渔业水质标准》(GB 11607—89)[21]规定，渔业养殖水体中非离子氨氮含量不应超过0.02 mg·L-1，但是我国近海的氨氮污染程度远超过这一临界值。我们前期研究发现，0.1 mg·L-1氨态氮可以对菲律宾蛤仔的溶酶体稳定性造成显著性影响，但是在实验条件下长期暴露不会造成蛤仔出现严重的死亡状况，所以本研究设2个浓度组：对照组(Control，0 mg·L-1)，低浓度暴露组(Low，0.1 mg·L-1)，每组设3个重复，每个重复包含菲律宾蛤仔35只，水温、投食、充气等养殖条件与暂养条件一致。每日定时换水一次，并维持各组NH4Cl的质量浓度。在暴露后的第1和30天取样，每组随机取6只菲律宾蛤仔，取其鳃组织浸没于Trizol中，-20 ℃保存，用于RNA提取及后续实验。

1.2 RNA提取及cDNA合成

按照Trizol(TaKaRa，大连)试剂盒说明书提取样品的总RNA，NanoDrop 2000(Thermo Scientific, America)检测RNA的浓度和纯度，1%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。

RNA反转录成cDNA实验采用EraserPrime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大连)试剂盒，反应分为去除gDNA、反转录两步，体系(20 μL)如下：PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μL；RT Primer Mix 1.0 μL；5×PrimeScript Buffer 2 (for Real Time) 4.0 μL；RNase Free ddH2O 4.0 μL；总RNA 1 μg；去除gDNA的反应液10 μL。反转录条件为37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，产物-20 ℃保存。

1.3 引物设计及可用性验证

根据本课题组对菲律宾蛤仔鳃组织的转录组测序结果，选择18S rRNA (18S)、beta-actin (Actin)、beta-tubulin (Tubu)、elongation factor 1-alpha (EF1α)、Ubiquitin (Ub)、cyclophilin A (CyPA)等6个表达量较为稳定的基因作为备选管家基因。按照定量引物设计要求，利用Primer 5.0设计10对引物(表1)并由上海生工生物技术有限公司合成。

利用普通PCR反应验证引物的可用性，反应体系(25.0 μL)为：10× PCR Buffer (Mg2+free) 2.5 μL；dNTP Mixture 2.0 μL；MgCl21.5 μL；Taq 0.25 μL；ddH2O 15.75 μL；正向引物1 μL；反向引物1 μL；不同时间点鳃组织的混合cDNA 1.0 μL。反应条件如下：94 ℃、5 min，(94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s)× 36 cycles，72 ℃、10 min，4 ℃存放。反应结束后用1%的琼脂糖凝胶检测各扩增片段的单一性(图1)。

图1 10对备选内参基因引物的特异性检测电泳图注：1为18S1；2为18S2；3为Actin；4为Tubu1；M为DL 2000 Marker；5为Tubu2；6为EF1α1；7为EF1α2；8为Ub1；9为Ub2；10为CyPA。Fig. 1 Ten couples of specific primers for 6 target reference genes examined by agarose gel electrophoresisNote: 1 stands for 18S1; 2 stands for 18S2; 3 stands for Actin; 4 stands for Tubu1; M stands for DL 2000 Marker; 5 stands for Tubu2; 6 stands for EF1α1; 7 stands for EF1α2; 8 stands for Ub1; 9 stands for Ub2; 10 stands for CyPA.

1.4 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR(Real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)采用7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, America)进行，所用试剂盒SYBR Select Master Mix (Applied Biosystems, America)的反应体系(20.0 μL)如下：鳃组织稀释(10、50、100、500、1 000倍)模板cDNA 5 μL；正向引物0.6 μL；反向引物0.6 μL；SYBR Select Master Mix 10 μL；ddH2O 3.8 μL。反应程序：50 ℃、20 s，94 ℃、7 min，(94 ℃、10 s，60 ℃、30 s)× 40 cycles。

1.5 数据分析

用7500 System Software(Applied Biosystems, America)观察扩增曲线，将所得Ct值转化为相对定量数据2-ΔΔCt[22]，并用geNorm和NormFinder软件分别来分析基因的表达稳定性；采用Su等[23]的加权赋值方法，按照分数越小越稳定的原则，综合确定最适合的内参基因。

1.6 内参基因验证

以筛选出的内参基因，利用氨氮暴露1 d和30 d的菲律宾蛤仔鳃组织稀释50倍的cDNA为模板，采用1.4 qRT-PCR的体系与分析方法，对转录组中unigene 1 (c112601_g1)的表达情况进行定量分析，获得unigene 1在氨氮短期和长期暴露后的表达趋势，通过与unigene 1的转录组学数据变化趋势(log2FoldChange)相比较，验证最优内参基因的可用性。

2 结果(Results)

2.1 RNA、引物和cDNA质量检测

Nanodrop 2000检测样品RNA的OD260/280均在1.8～2.0之间，1%琼脂糖凝胶电泳检测有5S、18S、28S三条条带，说明RNA质量符合qRT-PCR的要求。

用不同处理组鳃组织的混合cDNA对备选内参基因进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳结果均为单一条带，并且与预期长度一致(图1)，其中6个基因的qRT-PCR结果显示，溶解曲线都只有明显的单一峰且重复性好(图2)。因此，所用引物都能够特异性地扩增其内参基因，且不存在引物二聚体，适用于qRT-PCR。舍弃同一基因的重复引物对，最后分别以18S1、Actin、Tubu1、EF1α1、Ub1和CyPA的正反向引物作为内参基因18S、Actin、Tubu、EF1α、Ub和CyPA的检测引物。

表1 内参基因的引物序列信息Table 1 Primer sequences for housekeeping genes

图2 6个备选内参基因扩增产物的溶解曲线Fig. 2 Melting curves of products from 6 reference genes

图3 geNorm分析NH3-N暴露后内参基因表达的稳定性Fig. 3 Stability value of reference gene expression after NH3-N exposure by geNorm

2.2 cDNA浓度确定

根据预实验结果，对样品鳃组织cDNA模板进行梯度稀释，稀释倍数分别为10、50、100、500、1 000。根据各对引物的扩增效果，发现cDNA模板稀释50倍时，除18S的Ct值在11.0左右外，其余各对内参基因的Ct值均在19.0～23.0范围内，比较适合作为检测的模板浓度。

2.3 内参基因的稳定性分析

2.3.1 geNorm软件分析结果

通过对氨氮暴露不同时间的菲律宾蛤仔鳃组织cDNA进行qRT-PCR扩增，利用geNorm软件分别分析18S、Actin、Tubu、EF1α、Ub和CyPA的2-ΔΔCt值，获得其表达稳定性的平均值M，依次为0.94、0.53、0.63、0.30、0.79和0.31。根据M值越小基因表达稳定性越高，M值越大基因表达稳定性越低的运算原理，可得出6个候选内参基因的表达稳定性由高到低依次为：EF1α>CyPA>Actin>Tubu>Ub>18S，EF1α和CyPA为6个内参基因中表达相对较稳定的内参基因(图3)。

geNorm软件通过计算内参基因的配对差异值Vn/(n+1)来确定内参基因的合适数目。程序以0.15为默认取舍值，即如果Vn/(n+1)小于0.15，说明候选内参基因中有n个适合作为qRT-PCR的内参基因，没必要引入第(n+1)个内参进行标准化校正[24]。本研究中Vn/(n+1)值均大于0.15 (图3)，因此需要改变取舍条件后再确定内参基因的合适数目。

2.3.2 NormFinder软件分析

根据NormFinder软件分析获得的稳定值(stability value)得知，6个备选内参基因的稳定性顺序依次为：EF1α>Actin>Tubu>CyPA>Ub>18S，其最优的内参基因为EF1α(表2)。

2.3.3 综合排名分析

根据geNorm和NormFinder这2种软件分析结果的排名次序，采用Su等[23]的加权赋值方法，给每种分析方法中每个基因的表达稳定性赋值，最稳定为1分，其次依次为2、3、4、5、6分，然后把每个基因所得分数相加进行重新排序，分数越小越稳定。根据表3统计结果可以看出，18S的最后得分最高(12)，其他依次为Ub (10)，Tubu (7)，CyPA (6)，Actin (5)，最小为EF1α (2)。因此，综合排名最稳定的基因为EF1α (表3)。

表2 NormFinder分析NH3-N暴露后的最优内参基因Table 2 The optimal reference gene after NH3-N exposure by NormFinder

2.4 内参基因的验证结果

通过geNorm软件分析发现，CyPA和EF1α都适合作为内参基因，但是通过NormFinder软件分析发现EF1α是最佳内参基因，最后根据Su等[23]的综合评价体系确定EF1α是最佳内参基因。为了验证EF1α是最佳的内参基因，分别以CyPA和EF1α基因作为内参，以转录组中的unigene 1(c112601_g1)为研究对象，通过qRT-PCR技术，对其进行表达情况分析。结果(图4)发现，以CyPA作为内参基因，unigene 1的表达呈现先下降后上升的趋势；而以EF1α作为内参基因分析发现，unigene 1的表达趋势为先上升后下降。后者与转录组学unigene 1的实际log2FoldChange表达趋势一致，而前者与之不符。

图4 以CyPA和EF1α作为内参研究目标基因的表达趋势分析Fig. 4 Expression profiles of target gene 1 using EF1α and CyPA as reference gene respectively

表3 geNorm和NormFinder分析稳定值排名Table 3 Stability value ranking by geNorm and NormFinder

3 讨论(Discussion)

筛选出具有特异性稳定表达的内参基因,是对转录组学的目标基因进行qRT-PCR分析的前提条件，通常情况下需要根据不同的实验条件或不同类型的细胞或组织来进行比较选择，近年来的研究结果发现，常用的内参基因均存在不稳定性，在qRT-PCR分析之前有必要对其稳定性进行重新评估[25]。如史艳艳等[26]研究在17α、20β双羟孕酮(DHP)诱导鲤(Cyprinus carpio)卵母细胞最终成熟过程中，18S rRNA、28S rRNA、CTSZ、EF1α、GAPDH和β-actin 6个备选内参基因的表达情况，同时应用不同的内参分析软件分析其表达稳定性，结果表明6个备选基因中表达最为稳定的是EF1α。刘颖等[27]选取了栉孔扇贝性腺组织为研究对象，分析了β-actin、β-TUB、EFlα、18S rRNA和GAPDH 5个备选内参基因在不同发育阶段和雌激素暴露条件下的表达水平，并应用RefFinder软件进行数据分析，发现栉孔扇贝不同发育阶段和雌激素暴露下的表达最为稳定的内参基因是EFlα。王琦等[28]研究了合浦珠母贝(Pinctada fucata)不同组织、性腺发育时期、胚胎发育时期GAPDH、β-actin和18S rRNA 3个备选内参基因的表达稳定情况，并应用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件分析表达稳定性的差异，最终发现β-actin在不同组织和胚胎发育不同阶段表达最稳定，18S rRNA在性腺发育不同时期表达最稳定。李迪等[29]研究了鳜鱼(Siniperca chuatsi) 8个不同胚胎发育阶段、5个胚后发育时期和8个成鱼组织中RPL13、RPL19、EF1α、RPL13α、B2M、hprt1和rps29 7个备选内参基因mRNA水平的表达稳定情况，geNorm软件分析后发现，不同发育阶段的稳定表达的内参基因不同：在不同胚胎发育阶段中表达最稳定的是EF1α和B2M，在胚后不同时期中表达最稳定的是EF1α和RPL13α，在鳜鱼成鱼不同组织中表达最稳定的是B2M和RPL13α。

本研究采用2种软件geNorm和NormFinder对菲律宾蛤仔体内6对常用的备选内参基因的表达稳定性进行独立研究，其中由geNorm软件可以得到内参基因的稳定性顺序，基因表达的稳定值M越小其稳定性越高；还可以通过标准化因子的配对差异分析(Vn/Vn+1)判定内参基因的最适数量，默认值为0.15 (Vn/Vn+1<0.15时不必使用内参数量> n+1的看家基因作为内参)。由软件分析结果(图3)可以看出，NH3-N暴露菲律宾蛤仔后，6个备选内参基因在鳃组织中表达稳定性依次为：EF1α>CyPA>Actin>Tubu>Ub>18S，EF1α和CyPA是表达最为稳定的2个内参基因。另一方面，各组的Vn/Vn+1都大于0.15，按照geNorm软件设定的默认条件Vn/Vn+1≤0.15来取舍，应该选择≥n+1个看家基因来做内参，不过geNorm操作手册中也提到0.15也非其最大设定值。由于本次实验设定的暴露时间范围(0～30 d)跨度大，样本间基因表达差异较大，所以可以选择1个或者2个较优的管家基因作为内参基因，而不必拘泥于Vn/Vn+1≤0.15，蒋婷婷等[30]在筛选石蒜属植物的内参基因实验中也遇到了类似的问题。

NormFinder是由Andersen等2004年开发的另一款用于筛选稳定内参基因的软件，其运行结果以稳定值的大小排序。与geNorm相似的是，NormFinder中表达稳定值越小意味着该基因表达越稳定。此外，NormFinder运算结果中还提示最优的内参基因。本研究实验条件下，各内参基因在鳃组织中的表达稳定性从高到低的排序为：EF1α>Actin>Tubu>CyPA>Ub>18S，最优的内参基因为EF1α。

由于geNorm和NormFinder软件的筛选结果中存在一定的差异，因此需综合2种软件的排序结果来统一分析。在这里采用Su等[23]的加权赋值方法，按照分数越小越稳定的原则，综合确定最适合的内参基因。分析得出内参基因表达稳定性综合排序为：EF1α>Actin>CyPA>Tubu>Ub>18S，这一结果中EF1α最为稳定。从而，进一步确定出在氨氮暴露后的鳃组织中最优的内参基因为EF1α。

为了验证上面的筛选结果，我们以转录组中随机一个unigene(c112601_g1)为对象，利用EF1α和CyPA作为内参基因，对目的基因的表达趋势进行验证(图4)。qRT-PCR结果和转录组学数据比对后，发现以EF1α作为其内参基因获得的表达趋势和实际转录组获得数据的变化趋势一致，但CyPA并非如此。由此可知，菲律宾蛤仔受到氨态氮暴露后，EF1α可以作为最佳的内参基因进行鳃组织转录组学分析。

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◆

Selection of Reference Genes for Toxicological Mechanism Research onRuditapesphilippinarumExposed to Ammonia Nitrogen

Cao Tengfei1, Cong Ming2,, Li Zhaoyan3, Zhao Jianmin2, Lv Jiasen3, Li Chenghua1

1. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China2. Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China3. College of Life Science, Yantai University, Yantai 264005, China

27 July 2016 accepted 28 August 2016

In order to analyze the transcriptome data accurately and systemically, a suitable reference gene is necessary. In the present study, geNorm and Normfinder softwares were used to analyze the expression stabilities of six candidate reference genes of Ruditapes philippinarum after ammonia nitrogen exposure for 30 days. The reference genes included 18S rRNA (18S), beta-actin (Actin), beta-tubulin (Tubu), elongation factor 1-alpha (EF1α), cyclophilin A (CyPA) and Ubiquitin (Ub). Based on a 50-times diluted cDNA in gills as the quantitative real-time PCR template, the geNorm software analysis demonstrated that the expression stabilities of the six candidate reference gene after NH3-N exposure were as follows: EF1α>CyPA>Actin>Tubu>Ub>18S, and EF1α and CyPA were the best two ones among the six reference genes. A little different order was detected by the NormFinder software as follows: EF1α>Actin>Tubu>CyPA>Ub>18S. And EF1α was recommended as the optimal reference gene. As an assay, EF1α and CyPA were employed to examine one target unigene by qRT-PCR respectively. Final results showed that the variation trend detected by EF1α was more consistent with the foldchange value of the transcriptome. So EF1α was selected as the housekeeping gene to analyze the transcriptome data of gills in Ruditapes philippinarum after ammonia nitrogen exposure.

ammonia nitrogen; Ruditapes philippinarum; reference gene

国家自然科学基金(41406132)

曹滕飞(1992-)，男，硕士，研究方向为生态毒理和分子生物学，E-mail: caotengfei2012@163.com；

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: mcong@yic.ac.cn；

10.7524/AJE.1673-5897.20160727001

2016-07-27 录用日期：2016-08-28

1673-5897(2017)2-182-09

X171.5

A

丛明(1976-)，女，海洋生物学专业，博士，助理研究员，主要研究方向为海岸带生态毒理和分子生物学。

曹滕飞, 丛明, 李兆艳, 等. 氨态氮对菲律宾蛤仔毒理机制研究的内参基因筛选[J]. 生态毒理学报，2017, 12(2): 182-190

Cao T F, Cong M, Li Z Y, et al. Selection of reference genes for toxicological mechanism research on Ruditapes philippinarum exposed to ammonia nitrogen [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(2): 182-190 (in Chinese)