土壤Cd污染对跳虫Folsomiacandida的生态毒性

保琼莉，李文华，黄益宗,*，刘仲齐

农业部环境保护科研监测所重金属生态毒理研究室，天津 300191

土壤Cd污染对跳虫Folsomiacandida的生态毒性

保琼莉1，李文华1，黄益宗1,*，刘仲齐1

农业部环境保护科研监测所重金属生态毒理研究室，天津 300191

采矿及冶炼等行为造成了严重的土壤重金属污染，其中Cd污染及其带来的健康风险近年来引起人们的高度重视。利用弹尾目跳虫开展土壤Cd污染的生态毒理研究，对Cd污染土壤的生态风险评价具有重要意义。本研究将跳虫Folsomia candida (F. candida)暴露在不同Cd浓度污染的人工土壤中，利用跳虫存活数量、繁殖数量及回避行为实验来评价重金属Cd污染对跳虫的生态毒性。结果表明，Cd对F. candida的急性毒性LC50值为2 086.93 mg·kg-1，慢性毒性的繁殖抑制(28 d)EC50值为224.95 mg·kg-1。此外，Cd对跳虫回避行为影响的EC50(48 h)为721.26 mg·kg-1。可以看出，慢性毒性的EC50值与Cd对回避行为影响的EC50值近似，但远低于急性毒性LC50值。因此，跳虫F. candida的回避行为和繁殖率对Cd污染土壤有较高的灵敏度，可用来表征土壤中Cd的生态毒性。

人工土壤；Cd；跳虫；F. candida；急性毒性；慢性毒性；回避行为

随着社会经济的发展，人类工农业生产过程中产生的各种污染物通过不同途径进入土壤环境，最终超过土壤自净能力，使土壤质量与功能发生变化，危及人类及其他生物的生存和发展，即土壤污染[1]。土壤作为一个开放体系，与其他生态系统有着重要的交互作用，研究重金属污染土壤意义重大。目前，土壤重金属污染受到全球性的关注。土壤重金属污染成为食品安全及人类健康的最大风险[2]。土壤重金属除了来自土壤母质外，其他来源都与人为活动密切相关，包括采矿、冶炼、污水灌溉、污泥再利用及农业化肥等[3-4]，其中采矿是最严重的重金属污染源[5]。在诸多重金属中，Cd污染及其带来的健康风险越来越引起人们的高度关注。如Liu等[6]发现在尾矿覆盖的土壤中Cd浓度达到了安全值的13倍。Li等[7]统计了2005—2012年间发表的有关我国重金属污染的数据，发现我国有65%的矿区中Cd的重金属地质累积指数Igeo超过4级(重金属含量为背景值的100倍时，划为第六等级)，据Igeo推断Cd污染程度最高。Zhuang等[8]的研究表明水稻土中的Cd浓度达到了我国土壤环境质量二级标准的13倍。Cd没有任何必需的生物学功能，在生物体内达到一定浓度时都会损坏生物细胞膜，能与硫基基团(-SH)结合，进而会影响人体多种酶的活性，影响细胞内正常的生理功能、并破坏生物体的DNA结构[9]。

跳虫又名弹尾虫(springtails)，是弹尾纲(collembolan)生物的俗称，是一种分布极为广泛的土壤节肢动物，与线虫、螨虫共同构成三大土壤动物，在土壤生态系统中扮演着重要角色[10-11]。跳虫是土壤生态系统的重要组成部分，它们通常个体小，与土壤颗粒和孔隙水直接接触，将它们暴露在污染土壤中，其毒害效应要比其他动物更容易被观测到。跳虫因生长周期短，繁殖快，易于实验室人工培养，操作简便等优势，被长期用于土壤生态毒理学实验，成为土壤生态风险评价中重要的模式生物[11]。而白符跳(Folsomia candida)则是在生态毒理实验中应用最为广泛，技术最为成熟的一种跳虫[12]。F. candida是目前在土壤生态风险评价中应用最为广泛的一类跳虫，F. candida的栖息地主要是有机质含量比较高的地区。F. candida有非常发达的弹器，受到外界刺激会很快做出反应并且出现弹跳行为。F. candida为卵生，生殖方式为孤雌生殖。

国外利用跳虫开展生态毒理研究较早[12]，国内的研究相关报道较少。有关重金属对跳虫的毒理效应研究主要集中在Hg[13]和Cu[14-15]等污染，而Cd污染的研究较少有报道。随着ISO 11267[16]和ISO11573[17]跳虫毒理实验国际标准的发布，利用跳虫来评价土壤环境中重金属污染有了指导规范。本研究以跳虫F. candida为实验材料，探讨了不同浓度的土壤Cd污染对跳虫生存、繁殖和回避行为的影响，获得相关的毒理数据，为开展Cd污染的土壤生态风险评价提供基础数据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 仪器与试剂

主要仪器：人工气候箱(三洋MLR-351H)，体视显微镜(奥林巴斯SZ610)，AR224CN型电子天平，YD126-KD-8089型计数器，其他仪器为实验室常规仪器。

主要试剂：CdCl2，分析纯，购自国药试剂公司。

1.2 实验动物与培养条件

供试跳虫F. candida，孤雌生殖，来自中国科学院生态环境研究中心。跳虫培养方法：跳虫放入90 mm×13 mm的培养皿中饲养，培养皿底部有一层约0.5 cm厚的石膏/活性炭基质(熟石膏、活性炭和蒸馏水按9∶1∶7的质量比混合而成)，加入少量干酵母作为跳虫的食物，每周换食并补充水分，清除培养基上的食物残渣和跳虫尸体，保持培养基清洁湿润，每2个月更换一次培养基。培养皿放入人工气候箱中，温度为(20±1) ℃，湿度为(70% ± 5%)，12 h∶12 h的光照与黑暗循环，光照强度为400～800 lux[11]。

1.3 实验方法

1.3.1 跳虫同龄化

为了降低跳虫虫龄和个体大小差异对实验的影响，实验前跳虫需进行同龄化。参考ISO 11267-1999中跳虫同龄化方法进行实验操作。从跳虫数量多并且活跃的培养皿中转移约60只成虫至新的有基质的培养皿中，加入干酵母，然后放入培养箱中培养，每天进行观察。当发现有幼虫孵出时移走成虫，此后第3天将幼虫转移到新的培养皿中培养，这些幼虫即可认为是同龄化的跳虫[11]，F. candida幼虫培养至9～12 d即可用于实验。

1.3.2 人工土壤配制

将10%的泥炭(无明显植物残体，自然风干2 d，烘干1 d，并过2 mm筛)、20%的高岭土(粉末状，高岭石含量>30%)和70%的石英砂(至少50%的颗粒粒径范围为0.05～0.2 mm)混合均匀，调节土壤含水量为最大持水量的45%，有机质含量为7%，用CaCO3调节pH至6.0±0.5，密封室温保存。由于土壤pH、有机质含量及含水量对跳虫的生长繁殖有一定的影响，为了消除其他因素对实验的干扰，我们采用了ISO 11267-1999推荐的人工土壤进行实验[11]。石墨炉原子吸收光谱法测定人工土壤的Cd含量为0.001 mg·kg-1。

1.3.3 Cd污染人工土壤的制备

参照ISO 11267-1999，溶于水的化学品，以溶液的形式喷洒入人工土壤。Cd以CdCl2形式加入，先按设定浓度称取CdCl2试剂，然后将称好的CdCl2溶于去离子水中，用小喷壶均匀喷洒于人工土壤中并充分混匀。土壤染毒后，再补充去离子水至最大持水量的50%。对照中不加Cd，调节土壤含水量至最大持水量的50%。染毒土壤及对照均在20 ℃的黑暗条件下平衡48 h。

1.3.4 急性存活实验

1)滤纸法急性存活实验(实验方法参照ISO 11267-1999)：设置8个Cd浓度处理，分别为0、200、400、800、1 600、2 400、3 200、4 000 mg·kg-1，每处理设置5个重复，对照组设6个重复；在培养皿中铺垫上滤纸，加入不同浓度的Cd溶液，刚好浸透滤纸，每隔24 h加入微量蒸馏水补充蒸发水分，以保持滤纸湿度，各培养皿中加入同步化的成虫，在人工气候箱中培养，培养条件同跳虫饲养条件；在培养24 h、48 h及72 h观察跳虫死亡情况，记录死亡个数。

2)人工土壤急性存活实验(实验方法参照ISO 11267-1999)：设置8个Cd浓度处理，分别为0、200、400、800、1 600、2 400、3 200、4 000 mg·kg-1，每处理设置5个重复，对照组设6个重复。将30 g染毒土壤装入100 mL烧杯中，然后每个烧杯中加入已同龄化的10只跳虫，用封口膜封口，在人工气候箱中培养，培养条件与跳虫饲养条件相同。实验进行7 d后取出烧杯，加入一定量的蒸馏水，存活的跳虫因体表分泌油脂会漂浮到水面上，用水悬浮法记录存活跳虫的数量。

1.3.5 回避实验

实验方法参照ISO 17512-2，略有改动。设置8个Cd浓度处理0、50、100、200、400、600、800、1 000 mg·kg-1，每处理设置4个重复，用隔板将回避实验用的特制圆柱形玻璃杯分隔为两部分，两部分分别加入30 g Cd污染土壤和对照土壤，然后将隔板取出，在玻璃杯的中心位置加入已经同龄化的20只跳虫，再用封口膜进行封口，放入人工气候箱中进行培养，培养条件同跳虫饲养条件。跳虫培养48 h后取出玻璃杯，小心插入隔板，将两部分土壤分别取出，再用水悬浮法计数跳虫数量。回避率计算方法：X=nc/N×100%(X为回避率；nc为对照土壤中跳虫数量；N为加入土壤中的总跳虫数)，即空白对照土壤中的跳虫占总跳虫数的百分比。当空白对照土壤中的跳虫数量占总数的70%以上时，可认为污染物对跳虫的环境行为产生了明显影响[17]。实验过程如图1。

图1 跳虫回避实验过程注：WHC表示田间持水量，70% h表示人工气候箱相对湿度。Fig. 1 The avoidance behavior experiment process of F. candidaNote: WHC stands for water holding capacity, 70% h stands for relatively humidity of climatic cabinate.

图2 跳虫存活率及慢性繁殖抑制实验过程图Fig. 2 The survival and reproduction experiment processes of F. candida

1.3.6 慢性繁殖抑制实验

实验方法参照ISO 11267-1999，略有改动。设置Cd污染7个浓度处理0、20、80、150、300、600、1 200 mg·kg-1，每组处理设置5个重复，对照组为6个重复。将30 g Cd土壤加入100 mL的烧杯中，然后将10只同龄化跳虫放入装有Cd污染土壤的烧杯中，同时加入5 mg干酵母作为跳虫食物，封口膜封口烧杯，然后放入人工气候箱中培养，培养条件与跳虫饲养条件相同，每周开口通气，清除土壤表面杂质及腐烂食物，补充1 mL去离子水，补充少量干酵母(约2 mg)。实验进行28 d后取出烧杯用水悬浮法分别记录成虫和幼虫的数量。实验过程如图2。

1.4 数据处理

数据用平均值±标准差(mean ± SD)表示，采用SPSS 16.0、SAS软件对实验数据进行分析，显著性差异采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，SSR法进行平均数间的多重比较，P<0.05为差异显著。SPSS 16.0软件进行Probit回归分析计算Cd对跳虫的半致死浓度(LC50)和半数效应浓度(EC50)。

2 结果与分析(Results and analysis)

2.1 滤纸法急性存活实验

滤纸法跳虫存活实验结果如图3，在Cd污染浓度低于3 200 mg·kg-1的滤纸上暴露24 h后，跳虫未受影响，而当Cd污染浓度达到4 000 mg·kg-1时，存活跳虫数量显著降低(存活8只)(F=5.65，P<0.01)。跳虫在Cd污染浓度低于1 600 mg·kg-1的滤纸上暴露48 h后，存活跳虫数量有下降趋势，当Cd污染浓度达到4 000 mg·kg-1时存活跳虫显著降低(存活7只)(F=7.43，P<0.01)。跳虫在Cd污染浓度大于200 mg·kg-1的滤纸上暴露72 h后，存活跳虫数量开始下降，当Cd污染浓度大于800 mg·kg-1时，存活跳虫数量显著下降(F=23.24，P<0.01)。表明跳虫在不同Cd污染浓度下暴露不同时间后，存活的跳虫数量不同。暴露时间越长，相同Cd污染浓度对跳虫毒害程度越大。

图3 跳虫在Cd污染滤纸中暴露不同时间后的存活数注：不同字母代表处理间达显著性差异(P<0.05)。Fig. 3 Number of F. candida survived after exposure to Cd-contaminated filter paper for different timeNote: The different letters indicate significant difference at 5% level within different treatments.

2.2 人工土壤急性存活实验

人工土壤跳虫急性存活实验结果如图4，随着Cd浓度的增加死亡的跳虫数逐渐增加，存活数减少，在Cd浓度大于400 mg·kg-1时，各个浓度处理条件下，跳虫存活数与对照中跳虫存活数均有显著性差异(F=48.94，P<0.05)，当Cd浓度达到4 000 mg·kg-1时，跳虫几乎全部死亡。跳虫的急性存活实验灵敏度较低，一般作为回避实验和繁殖实验的预实验，以便确定后续实验的Cd浓度。

图4 跳虫在Cd污染土壤中暴露7 d后的存活数注：不同字母代表处理间达显著性差异(P<0.05)。Fig. 4 Number of F. candida survived after exposure to Cd-contaminated soil for 7 daysNote: The different letters indicate significant difference at 5% level within different treatments.

图5 跳虫在Cd污染土壤中暴露48 h后的回避行为注：不同字母代表处理间达显著性差异(P<0.05)。Fig. 5 Avoidance behavior of F. candida after exposure to Cd-contaminate soil for 48 hoursNote: The different letters indicate significant difference at 5% level within different treatments.

2.3 回避实验

如图5所示，随着Cd浓度的增加，跳虫的回避率逐渐提高，在Cd浓度为1 000 mg·kg-1时，跳虫回避率达82.5%。在设定的Cd浓度大于200 mg·kg-1时，跳虫开始表现出回避行为。在Cd浓度为800 mg·kg-1时，跳虫回避率超过70%，跳虫表现出明显的回避行为。可以看出，跳虫的急性回避实验周期短，比急性存活实验更加灵敏，能够更灵敏地表征Cd对跳虫的生态毒性[18]。

2.4 慢性繁殖抑制实验

如图6所示，跳虫成虫数量没有随Cd浓度的增加而明显减少，仅在最高浓度1 200 mg·kg-1时有部分成虫死亡。跳虫繁殖的幼虫数量随着Cd浓度的增加而减少，在Cd浓度大于80 mg·kg-1的各处理，幼虫数量与对照组之间均有显著性差异(F=119.14，P<0.05)。在最高Cd浓度处理下(1 200 mg·kg-1)，跳虫繁殖的幼虫数量仅为对照组的6%，表明Cd对跳虫的繁殖有抑制作用，产生了慢性毒性效应。跳虫繁殖幼虫的数量一般同成虫数量保持正相关，成虫死亡数增加，繁殖幼虫数量减少，与本实验相符。一般随着污染物浓度的增加，跳虫繁殖幼虫数量会不断减少。

图6 跳虫在Cd污染土壤中暴露28 d后成虫存活数量和繁殖幼虫数量注：不同字母代表处理间达显著性差异(P<0.05)。Fig. 6 Reproduction and survival of F. candida after exposure to Cd-contaminated soil for 28 daysNote: The different letters indicate significant difference at 5% level within different treatments.

2.5 跳虫实验参数比较

用半数致死浓度LC50和半数效应浓度EC50来评价Cd对跳虫毒性大小(表1)。Cd对跳虫的半数致死浓度LC50为2 086.93 mg·kg-1；跳虫的回避行为半数效应浓度EC50为721.26 mg·kg-1；Cd对跳虫繁殖毒性的半数效应浓度EC50为224.95 mg·kg-1。可以看出，EC50要远小于LC50，EC50更灵敏。表明回避实验和慢性毒性实验更适合进行Cd的生态毒性评价，且繁殖抑制对土壤Cd污染更敏感。

3 讨论(Discussion)

在我国，有关Cd对F. candida的毒理效应的基础研究仍比较缺乏，利用人工土壤研究Cd对F. candida的毒性，能够为我国以Cd污染自然土壤为基质研究Cd对F. candida毒理效应提供参考，同时为研究Cd污染土壤的生态风险评价提供基础毒理数据。跳虫的4种毒性实验均能从不同方面表征土壤中Cd的生态毒性，其中急性毒性实验和回避实验暴露时间较短，用于评价重金属Cd对跳虫的急性毒性。而繁殖实验暴露时间较长，用于评价重金属Cd对跳虫的慢性毒性。

滤纸法是一种皮肤染毒的方式，该方法便捷方便。滤纸法实验结果所显示的只是通过皮肤接触溶液所产生的毒性信息，较难反映重金属对环境的真实影响，但可以用于重金属对跳虫的潜在毒性的早期评估实验[15]。土壤暴露实验可能较溶液暴露实验更能反映实际的环境影响[19]。实际环境中重金属对跳虫的毒性可能不仅取决于重金属本身的毒性，而且可能与重金属在土壤中的行为及在跳虫体内的代谢过程相关。人工土壤法能够尽可能模拟自然土壤环境，使实验结果尽可能真实地反映自然界中重金属对跳虫的实际影响。Krogh研究[20]表明标准土壤实验中Cu对弹尾目F. candida的LC50平均值为1 541 mg·kg-1，本研究中Cd对F. candida的LC50值为2 086.93 mg·kg-1，表明不同重金属对跳虫的LC50值在不同的研究系统中有较大差异。重金属Hg对土壤跳虫的毒性研究有一些报道，如近期刘传栋等[21]研究了我国4种土壤跳虫对重金属Hg的响应，利用Bliss法测得4种跳虫的LC50值在35～92 mg·kg-1之间；董继鑫等[22]研究发现Hg在不同类型土壤中对F. candida的LC50为0.92～1.9。这些研究结果与本实验中Cd对F. candida的LC50有很大差异，这可能与跳虫自身性质差异、重金属类型、重金属胁迫时间以及LC50的计算方法等有关系。

表1 Cd对跳虫F. candida生态毒性实验的LC50和EC50值(mg·kg-1)Table 1 LC50 and EC50 values of Cd to F. candida in three ecotoxicity tests (mg·kg-1)

繁殖率的降低是生物体应对外界污染的措施，会直接影响种群的数量。因此繁殖率作为亚致死剂量水平研究的指标，一直是土壤污染物毒性研究的一个重要指示因子。跳虫繁殖率的EC50具有很高的有效性。本研究的繁殖抑制实验中EC50值为224.95 mg·kg-1，明显低于LC50值(2 086.93 mg·kg-1)，说明在土壤污染生态风险评估方面，跳虫的繁殖率实验优于跳虫死亡率实验。早期Sandifer和Hopkin[23]研究发现Cd对F. candida繁殖抑制的EC50值为590 mg·kg-1，高于本研究的EC50。Crommentuijn等[24]的研究表明当Cd浓度达到326 mg·kg-1时，F. candida的繁殖仍未受影响，而Menta等[25]的研究得出Cd对F. candida繁殖抑制的EC50值仅为47.2 mg·kg-1。Bur等[26]利用法国西南部的耕作土壤研究Cd对F. candida繁殖抑制的EC50值为182 mg·kg-1。van Gestel和Mol[27]利用人工土壤研究Cd对F. candida的毒性效应，其繁殖抑制半数效应浓度为193 mg·kg-1，该值与本研究的结果较一致。表明土壤性质对Cd的跳虫毒性效应有重要影响。其他重金属的相关研究国内也已有报道，如近期董继鑫等[22]研究发现Hg在不同土壤类型中对F. candida繁殖抑制的半数效应浓度值在0.98～2.43的范围，且土壤阳离子交换量(CEC)与EC50浓度呈显著正相关关系，指出CEC可能是导致不同类型土壤中Hg对F. candida的毒性差异的主要原因。Liu等[11]利用北京市郊区农田土壤研究Hg对跳虫的毒性效应，其繁殖抑制半数效应浓度EC50为9.28 mg·kg-1，该值显著低于本研究中Cd对F. candida繁殖抑制的EC50值，这可能与重金属本身及研究系统不同有关。另外，岳蕊丽等[14]研究发现低浓度的Cu能促进跳虫的繁殖，而本研究中低浓度的Cd处理并未促进跳虫的繁殖。

研究表明，跳虫能够感知土壤污染物的存在，从而发生迁移行为[28-29]，回避实验可以作为土壤污染的早期预警工具[30-31]。本研究中不同Cd暴露浓度下回避实验显示F. candida表现出对Cd污染的回避行为，对于高浓度Cd污染的土壤有明显的回避行为。回避反应的差异性可能与人工土壤中Cd的不均匀分布有关。本研究回避实验中EC50值为721.26 mg·kg-1，高于慢性繁殖率实验的EC50值(224.95 mg·kg-1)，表明对Cd污染的敏感度较死亡率的更高，而低于繁殖率实验的敏感度。本研究中F. candida能够对约1/3 LC50的Cd浓度产生明显回避行为。李晓勇等[15]对Cu的跳虫毒性研究发现，回避实验中跳虫对Cu污染的敏感性要高于死亡率实验和慢性繁殖抑制实验。Liu等[13]研究发现Hg对跳虫回避行为的EC50值甚至低于LC50的一半，表明F. candida对重金属污染的敏感性与重金属类型有关。跳虫在有机物污染的土壤中，其回避实验也表现出很高的敏感性。如张轩等[32]发现全氟辛烷磺酸盐(POFS)以及添加型溴代阻燃剂DBE-209对F. candida回避行为的EC50值显著低于LC50值，而高于慢性繁殖的EC50值。张偲等[33]考察2种有机磷阻燃剂邻磷杂菲基对苯二酚(ODOPB)和高分子双酚A四苯基双磷酸酯(SBDP)对F. candida毒理效应，发现繁殖抑制的EC50远大于回避行为的EC50，表明F. candida的回避行为对不同污染物的敏感性有很大差异。本研究表明慢性繁殖抑制实验对Cd土壤污染最敏感，用作土壤Cd污染生态风险评估的早期预警工具更具有优越性。

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Toxicity of Cd to Springtails (Folsomiacandida) in Soil

Bao Qiongli1, Li Wenhua1, Huang Yizong1,*, Liu Zhongqi1

Laboratory of Heavy-metal Ecotoxicity, Agro-Environmental Protection Institute, Ministry of Agriculture, Tianjin 300191, China

25 April 2016 accepted 12 September 2016

Mining and smelting behaviors caused serious soil pollution by heavy metals. The health risk of Cd pollution has drawn great attention in recent years. The study on ecotoxicology of Cd contaminated soil to collembolan springtails is of great significance for ecological risk assessment. In this study, springtail species (F. candida) were exposed to soil contaminated with Cd. Ecotoxicity of Cd was assessed using the survival and reproduction, as well as the avoidance behavior of F. candida. LC50value of Cd in acute toxicity test was 2 086.93 mg·kg-1for F. candida. EC50value in chronic reproduction toxicity test was 224.95 mg·kg-1for F. candida. EC50value in the avoidance behavior test was 721.16 mg·kg-1for F. candida. Accordingly, avoidance behavior and reproduction of F. candida were significantly influenced by the presence of Cd, which would have great potential applications for accessing the toxicity of Cd contamination in soils.

Cd; F. candida; acute toxicity; chronic toxicity; avoidance behavior

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项项目(2015-szjj-bql)；国家科技支撑计划项目(2015BAD05B02)

保琼莉(1982)，女，助理研究员，研究方向为重金属生态毒理学，E-mail: qionglibao1982@163.com

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: yizonghuang@126.com

10.7524/AJE.1673-5897.20160425001

2016-04-25 录用日期：2016-09-12

1673-5897(2017)2-169-08

X171.5

A

黄益宗(1970—)，博士，研究员，主要从事重金属在土壤和植物系统中的迁移和转化、污染土壤修复、酸沉降和臭氧污染胁迫对典型农田、森林生态系统影响机理等方面的研究工作。

保琼莉, 李文华, 黄益宗, 等. 土壤Cd污染对跳虫Folsomia candida的生态毒性[J]. 生态毒理学报，2017, 12(2): 169-176

Bao Q L, Li W H, Huang Y Z, et al. Toxicity of Cd to springtails (Folsomia candida) in soil [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(2): 169-176 (in Chinese)