不育男性精液常规参数与年龄、精子DNA碎片率和精子顶体功能的相关性研究

刘树沅，韦剑洪，许小琴，陈伟辉

(中山市博爱医院生殖中心，广东中山528403)

不育男性精液常规参数与年龄、精子DNA碎片率和精子顶体功能的相关性研究

刘树沅，韦剑洪，许小琴，陈伟辉

(中山市博爱医院生殖中心，广东中山528403)

目的探讨不育患者精液常规参数与年龄、精子DNA碎片率和精子顶体功能存在的相关性。方法选择2015年3月-2016年2月期间在本院接受体外受精-胚胎移植（IVF-ET）治疗的112例不育男性患者，按照年龄将患者进行分组，对其实施精液常规、精子DNA碎片率和顶体功能检测，观察分析两组数据中精液常规参数与精子功能参数存在的相关性。结果年龄＞40岁组患者精子DNA碎片率显著高于年龄≤40岁组（P＜0.05）；精液常规参数与不育男性年龄负相关；两组患者精液常规参数与其精子DNA碎片率和精子顶体功能之间均存在显著性差异（P＜0.05）。结论精子DNA碎片率及顶体功能作为精液常规以外的检测手段，对不育男性患者精液质量评估、不孕原因分析以及生育能力评估具有重要的指导意义。

不育；精液常规；精子DNA碎片率；顶体功能

对男性生育能力进行评估的基础方法为对其精液质量进行分析，精液质量在不育患者临床诊断及治疗上均表现重要意义[1]。临床上对患者实施精液常规检查所得数据在大体上能够反映精子质量，但在该类患者不育原因分析和生育能力评估上还存在一定局限性，因为不育男性患者约30%精液常规结果正常，但却难以实现生育愿望。随着检测技术的发展，人们逐渐认识到精子功能存在缺陷是导致男性不育的一个重要原因，其检测有助于男性不育原因的分析。因此，通过对不育男性患者实施相关检测，对其精子功能进行准确评估，对患者治疗方案的制定具有重要意义。本次研究主要探讨不育患者精子常规参数与其精子DNA碎片率、精子顶体完整率、精子自发顶体反应率和年龄之间存在的相关性，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取112例于2015年3月-2016年2月期间在我院接受IVF-ET助孕治疗的不育男性作为研究对象。入选标准：无性功能障碍史者；无睾丸、附睾异常以及输精管异常者；无染色体异常以及激素紊乱者。排除标准：由于支原体、衣原体、细菌等病原微生物感染导致精子质量受到影响者；功能性、器质性不育者；最近1个月内有使用过对精子功能产生影响的相关药物进行治疗者。患者年龄：最小为23岁，最大为56岁，平均（35.64±2.51）岁，其中，年龄≤40患者为72例，年龄＞40岁患者为40例。

1.2 方法

1.2.1 精液常规检测按照WHO实验室手册（第5版）采集和处理精液。患者检测前均须禁欲2～7d，通过手淫法对精液标本进行采集。采集到的样本放置于清洁广口无菌塑料杯中，杯子放置于温度为37℃的恒温板上，待标本液化后应用西班牙CASA精液质量分析系统实施精液常规分析，所有操作均须在采集后60min内完成，使用Diff-Quik染色法分析精子形态。

1.2.2 精子DNA完整性检测应用精子核染色质发散法（SCD），使用深圳博锐德生物科技有限公司提供的试剂盒，严格按照试剂说明书进行实验操作。

1.2.3 精子顶体功能检测采用PSA-FITC荧光标记法顶体染色（安徽安科生物工程股份有限公司试剂盒）。第一次洗涤：取0.2ml的精液标本放置于锥形试管中，加入5ml的生理盐水，1000r/min× 10min；第二次洗涤：弃上清，将5ml生理盐水加入，均匀混合，1000r/min×10min；上游法：将上清弃去，保留剂量为0.2～0.4ml，轻缓将1.2ml的BWW培养液加入精液上方，倾斜离心管为45°，37℃，1h；缓慢竖直试管，将最上层液吸取，吸取量为1ml，放入锥形试管，将5ml生理盐水加入，1000r/ min×10min，弃去上清，保留0.2～0.4ml；取精子悬液5μl进行涂片，制成2张涂片，长度均为1cm左右，待其自然干燥；使用浓度为95%的乙醇进行30min的固定；将60～100μl的PSA-FTTC工作液加入，放置于4℃环境中2～17h；使用纯净水冲片，荧光显微镜蓝光激发，放置于400倍镜下进行观察。

1.3 判定标准精子DNA碎片化判定标准：精子头部有光晕，但光晕的宽度＜精子核直径的1/3，精子头部没有光晕，头部不着色，或者核形态无规则性。精子DNA碎片率为精子DNA碎片化在观察精子总数中所占比例。顶体完整精子判断如下，顶体完整（AI）：精子头部有超过1/2荧光染色明亮且具有均匀性；已发生顶体反应（AB）：精子仅在赤道带存在荧光带，或顶体区无荧光染色；除上述两类精子之外的所有精子仅判定为顶体异常。

1.4 统计学分析方法以百分率表示研究中的计数资料，实施χ2检验，计量资料以均值±标准差（x± s）表示，实施t检验。研究中数据统计学分析均凭借SPSS 20.0统计软件包进行。以P＜0.05表示差异性、相关性存在显著性，检验水准α=0.05。相关性实施Spearman分析。

2 结果

2.1 不同年龄患者精子功能参数情况2组患者精子功能检测结果显示，年龄＞40岁组患者的精子DNA碎片率为1.51%～9.11%，平均（3.93±1.32）%，明显高于年龄≤40岁组，组间差异对比存在显著性（P＜0.05），见表1。年龄＞40岁组患者的精子顶体完整率为85.84%～92.25%，平均（89.17±13.53）%，与年龄≤40岁组比较未存在显著性差异（P＞0.05），详见表2。年龄＞40岁组患者的精子自发顶体反应率为1.39%～3.89%，平均（2.57±1.54）%，与年龄≤40岁组比较未存在显著性差异（P＞0.05），详见表3。

表1 不同年龄患者精子DNA碎片率比较

表2 不同年龄患者精子顶体完整率比较

表3 不同年龄患者精子自发顶体反应率比较

2.2 患者年龄与精子功能参数相关性不育患者的年龄与精子DNA碎片率表现正相关，与精子顶体完整率和精子自发顶体反应率均未表现出显著性相关，见表4。

表4 患者年龄与精液功能参数相关性

2.3 不同年龄患者精液常规参数情况精液常规检测结果显示，＞40岁组、≤40岁组患者在精液浓度、前向运动百分率、正常形态率几项精液常规参数比较上均存在显著性差异（P＜0.05），≤40岁组患者精液浓度、前向运动百分率、正常形态率均明显高于＞40岁组患者，组间差异对比有统计学意义，见表5。

表5 不同年龄患者精液常规参数情况

2.4 精液常规参数与精子DNA碎片率、精子顶体功能的相关性精子DNA碎片率与患者精液浓度、前向运动百分率、正常形态率均表现为显著性负相关（P＜0.05）；精子顶体完整率与精液浓度、前向运动百分率、正常形态率表现为显著性正相关（P＜0.05）；精子自发顶体反应率与前向运动百分率、正常形态率均表现为显著性负相关（P＜0.05），与精液浓度无显著性相关（P＞0.05）；精子DNA碎片率与精子顶体完整率表现为显著性负相关（P＜0.05）；精子自发顶体反应率与精子DNA碎片率表现为显著性正相关，与精子顶体完整率表现为显著性负相关（P＜0.05），详情见表6。

3 讨论

精子DNA的完整性是父系遗传信息传递给子代的前提，当精子在发生过程中出现异常，或者体外环境发生改变等相关内源性以及外源性因素的影响下，精子DNA均有可能受到损伤。有研究表明，男性不育可能与精子DNA损伤紧密相关，不育男性的精子DNA断裂水平高于生育男性[2]，精液指标正常的特发性不育患者，其精子DNA碎片率也增高[3]，精子DNA损伤会对自然生育、辅助生殖技术治疗结局产生负面影响[4]。顶体为覆盖于精子细胞核前面的扁囊状结构，由高尔基体特化而来，是精子所特有的一种细胞结构。在受精过程中，精子顶体能够与卵子透明带相互结合，然后通过透明带糖蛋白受体对顶体反应产生诱发作用，进而促进顶体内容物得到有效释放，这个过程是精子穿透以及精卵相互结合得以完成的关键性环节[5]。研究表明，存在于精子顶体内的蛋白水解酶（顶体酶）与受精过程密切相关[6]，精子顶体酶是判断精子生育能力很有价值的指标[7]，精子顶体酶含量降低会引起精子生育能力下降[8]，而顶体酶容易从顶体不完整的精子漏出，在受精过程中，精子必须完成顶体反应，释放顶体细胞溶解酶，使得精子在穿透透明带过程中产生一条轨道，协助精子穿过透明带与卵子结合[9]。当无顶体精子无法与卵子透明带以及卵黄膜相关融合时，精子会在与透明带相互结合之前便发生自发顶体反应，进而失去受精能力[10]。所以，进行精子DNA完整性检测以及精子顶体功能检测，在男性精液质量、精子功能和生育能力评估上具有重要意义。

表6 患者精液常规参数与精子功能参数相关性

目前，临床上主要应用SCD法对精子DNA完整性进行检测，进而对精子DNA状态进行评估。该种方法操作简单，检测结果准确性及可靠性较高，且易于推广。检查精子顶体完整性的方法有普通光镜染色、免疫化学染色技术以及改良巴氏技术染色，这些方法对操作者的要求较高，也较复杂，得不到很好的推广应用。本研究采用FITCPSA法对精子顶体功能进行检测，能够实现对精子顶体完整性进行科学评估，同时该种检测方法能够解决常规形态学方法不能有效判别精子自发顶体反应问题，检测结果更具客观性和科学性[11]。

Garjani A[12]等临床研究结果显示，随着年龄的增加，男性的生育能力表现出逐渐下降的趋势，且其配偶发生自发流产风险会逐渐升高。但是该方面具体作用机制目前还尚未形成一个统一定论，相关研究还有待于进一步深入[13]。本次研究所得数据显示，年龄增加会对不育男性精液浓度、前向运动百分率以及正常形态率等精液常规参数产生明显影响，且二者表现为显著性负相关。这个研究结果表明，随着年龄的增加，男性的精液质量会逐渐下降，年龄超过40岁时，男性相关精液参数均有明显降低。比较检测结果显示，年龄＞40岁组患者的精子DNA碎片率明显高于年龄≤40岁组，组间差异对比存在显著性（P＜0.05），高龄男性在受精、其配偶在胚胎发育过程中发生染色体异常、基因缺陷的风险也会更大。精子DNA碎片率与患者精液浓度、前向运动百分率、正常形态率均表现为显著性负相关（P＜0.05），这与Moskovtsev SI等[14]有一致的结论；精子DNA碎片率与精子顶体完整率、自发顶体反应均存在显著的相关性，这提示着精子的缺陷可能存在多个合并因素。

顶体不完整包括：精子无顶体、顶体形态异常以及顶体在未接触卵子之前即发生自发顶体反应，从而导致顶体不完整。未经体外人为干预使用生理性或非生理性物质诱发，精子在生理条件下，体内自由基等影响因素作用下而自发发生顶体反应，即自发顶体反应，精子自发顶体反应在生理学方面具有一定的意义。精子顶体缺陷与男性不育密切相关，顶体完整率是反应顶体缺陷与否的重要指标，本研究结果提示：精子顶体完整率与精子正常形态率之间表现为显著性的正相关，两者差别有统计学意义，这说明精子正常形态率越高，精子顶体完整性就越好，精子形态异常往往合并精子顶体的缺陷，这与Sallam HN等[15]的研究结果一致。

因此，不育男性年龄与其精液质量存在密切关系，二者表现为显著性负相关，精子DNA碎片率和精子顶体完整率等精子功能存在显著的相关性，精子顶体完整率与精子正常形态率之间表现为显著性的正相关。精液常规参数检测和精子顶体相关功能检测可以作为互补的手段，为不育男性患者查找不育原因及治疗提供参考依据，而能否通过评估精子顶体功能及其反应能力，指导授精方式的选择和预测受精结局，则需要进一步的研究和探讨。

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The study of correlation between infertility male semen routine parameter，age，sperm DNA fragmentation rate and sperm acrosome function

LIU Shuyuan，WEI Jianhong，XU Xiaoqin，CHEN Weihui.
Reproductive Medical Center，Boai Hospital of Zhongshan City，Zhongshan Guangdong 528403，China.

Objective To study the correlation between infertility male semen routine parameter and some factors including age，sperm DNA fragmentation rate and sperm acrosome function.Methods A total of 112 infertile male patients who are treated by in vitro fertilization-embryo transfer（IVF-ET）in our hospital from March 2015 to February 2016 were selected，grouped according to the patients age，tested the implementation rate of semen routine，sperm DNA fragments and acrosome function，observed and analysis of two groups of data correlation between semen routine parameters and sperm function.Results Male patients more than 40 years old with sperm DNA fragments were significantly higher than age 40 years old or less group(P＜0.05)；Semen routine parameters showed a negative correlation with male age；Two groups of patients semen routine parameters and its rate of sperm DNA fragments and there were significant differences between sperm acrosome function(P＜0.05).Conclusion the rate of sperm DNA fragments and acrosome functions as semen routine detection means，in patients with infertility male semen quality assessment，analyzing the causes of infertility，and fertility assessment has important guiding significance.

∶Infertility；Semen routine；Sperm DNA fragmentation rate；Top body function

R446.19，R698+.2，R711.6

A

1674-1129(2017)03-0333-04

2016-12-26；

2017-05-08)

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.03.012

广东省中山市科技计划项目（编号：2015B1170）

刘树沅，男，1981年生，主管技师，大学本科，研究方向：主要从事辅助生殖及生殖医学实验研究。