不同抗原修复法对免疫组化HBcAg染色结果的影响

黄建平，杨映红，吴雪晶

不同抗原修复法对免疫组化HBcAg染色结果的影响

黄建平，杨映红，吴雪晶

HBcAg；抗原修复；免疫组织化学

HBcAg是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)的核壳结构蛋白，是HBV的核心成分，它包裹着HBV病毒核酸，易与HBcAb结合形成抗原抗体复合物而被吞噬。HBcAg主要存在于受感染的肝细胞内，其在血液中一般难以被检测，只有在肝细胞内才能检出。因此，组织学活检需行免疫组化染色明确诊断。HBcAg检测具有重要的临床指导意义和应用价值，是反映HBV存在及复制程度的直接指标，可与血液HBV DNA检测互补验证，但HBcAg检测常出现染色弱、定位不准确、染色阳性率低等问题。本文现采用不同的抗原修复法进行实验，以寻找最佳染色方法提高HBcAg染色的准确性和可靠性。

1 材料与方法

1.1 材料 选取福建医科大学附属协和医院2014年1月～2016年6月肝脏穿刺标本60例，另选取肝组织中HBcAg强表达为阳性对照，以肝组织中HBcAg不表达为阴性对照，切片厚3～4 μm，65 ℃烤箱烤片1 h。

1.2 试剂 一抗HBcAg、EliVision二抗试剂盒、柠檬酸修复液(pH 6.0)、EDTA修复液(pH 9.0)、胰酶、DAB显色试剂盒，均购自福州迈新公司。

1.3 方法 (1)柠檬酸高压修复法：将柠檬酸修复液按1 ∶100蒸馏水稀释后倒入高压锅中加热至沸腾，放入脱蜡水化好的切片，继续加热至喷气，2 min后移除热源，冷却至室温；(2)EDTA煮沸修复法：将EDTA修复液按1 ∶50蒸馏水稀释后加热至沸腾，放入脱蜡水化好的切片，维持最低档温度继续加热煮沸，20 min后移除热源，冷却至室温；(3)胰酶消化修复法：脱蜡水化后切片分别滴加胰酶50～100 μL，放入湿盒中37 ℃温箱孵育20 min，蒸馏水冲洗终止反应；(4)未修复法：组织切片经脱蜡水化后未做特殊处理。按照上述方法处理后的切片经PBS冲洗1次，3%H2O2孵育10 min；PBS冲洗1次滴加一抗HBcAg，室温25 ℃孵育120 min，PBS冲洗3次×3 min，滴加增强剂A，室温孵育20 min，PBS冲洗3次滴加二抗B，室温孵育30 min，PBS冲洗，DAB室温显色4 min，自来水冲洗，终止显色，苏木精复染1 min，0.5%盐酸乙醇分化10 s，0.5%氨水返蓝30 s，流水冲洗5 min，常规脱水、透明、封固。

1.4 结果判定 HBcAg呈棕黄色为阳性，主要定位于胞核或核周胞质，根据表达的强弱可以分为无阳性着色为阴性(-)，淡黄色为阳性(+)，深棕色为强阳性()。

1.5 统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，多组间两两比较采用χ2检验。

2 结果

60例切片分别经高压、煮沸、酶消化、未修复4种方法处理，HBcAg表达情况如下。(1)柠檬酸高压修复：59例(-)、1例(+)，阴阳性对照组均无表达；(2)EDTA煮沸加热修复：55例(-)、5例(+)，阳性对照组弱表达，阴性对照组无表达；(3)胰酶消化修复：57例(-)、3例(+)，阳性对照组弱表达，阴性对照组无表达；(4)未修复：53例(-)、1例(+)、6例()，阳性对照组强表达，阴性对照组无表达(图1～4)。

3 讨论

近年国内病理学及美国病理医师和肿瘤学会相继公布相关免疫组化染色规范章程[1]，明确规定病理标本必须经10%中性福尔马林固定。甲醛是应用最广泛的固定液，经甲醛固定的组织形态学良好，能有效保持细胞形态和组织结构的完整性及保存组织细胞内的各有效成分。但是甲醛固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成醛键，使组织中抗原决定簇被封闭。同时，由于甲醛的聚合作用，蛋白质分子间相互交联形成大分子网络，也导致抗原决定簇被掩盖，使部分抗原不能与抗体很好地进行反应，需通过一定的方法修复才能有效进行免疫组化染色。抗原修复能把因甲醛固定而改变的蛋白质结构重新恢复，使免疫组化染色获得新鲜组织的染色效果[2]。因此，抗原修复是免疫组化染色中非常关键的步骤。常用的抗原修复法包括热修复和酶消化等。加热抗原修复技术的发明被誉为病理学以及免疫组化的革命性突破[3]。自Shi等[4]首次提出以来，现已应用于日常免疫组化染色中。加热抗原修复主要能使甲醛固定过程中发生交联的蛋白质解离，进而暴露与抗体结合的抗原位点，最大程度地恢复在制片过程中损失的抗原性，使原来认为不能在石蜡切片上进行免疫组化的许多抗体获得良好的染色效果。加热修复包括高压修复、水浴加热修复和微波修复等。酶消化修复也是抗原修复的一种，其原理主要是通过消化作用破坏甲醛固定产生的蛋白交联，使抗原位点暴露；酶消化修复中用于消化的酶包括胰酶、蛋白酶及胃酶等。

①②③④

图1 柠檬酸高压修复：HBcAg无表达，EliVision法 图2 EDTA煮沸加热修复：HBcAg呈弱表达，EliVision法 图3 胰酶消化修复：HBcAg无表达，EliVision法 图4 未修复：HBcAg呈强表达，EliVision法

本实验60例肝穿刺组织切片HBcAg染色分别选择高压加热、煮沸加热、胰酶消化以及未修复4种不同抗原的修复方式，结果显示高压加热修复仅1例弱表达；煮沸加热修复5例弱表达；胰酶消化修复3例弱表达；未修复1例弱表达，6例强表达。阳性对照组织切片高压加热修复时无表达，煮沸加热及胰酶消化修复时弱表达，未修复时强表达。提示未修复处理效果最佳，煮沸加热修复和胰酶修复次之，高压修复效果最差。目前对于免疫组化过程中因甲醛固定引起的抗原封闭，应使用抗原热修复，打开引起抗原封闭的醛键以及交联蛋白，更充分地暴露抗原、增强染色。高温高压热修复法被认为是大多数抗原修复最为稳定和有效的方法之一[5-6]，然而本组实验结果与之相反，未修复的切片表达效果最好，高温高压修复的切片则表达最差。作者认为可能由于HBcAg是乙肝病毒的核壳结构蛋白，属于乙肝病毒的一部分，并非人体组织结构成分，因而甲醛固定时并不一定被其封闭。根据Mason等[7]报道甲醛固定所致的蛋白质交联反应提供加热修复抗原的可能性，甲醛与蛋白质的交联物保存抗原的分子结构，使其免受高温加热的影响，而加热能打断交联物，暴露抗原达到修复的目的。提示抗原被甲醛固定封闭是加热抗原修复取得良好效果的前提，但如果抗原未被甲醛固定封闭，加热修复反而因为高温使蛋白质抗原发生变性，失去与抗体结合的能力，从而减弱表达甚至不表达。本组实验也恰好验证这一结果，高压修复组因为修复最为激烈，温度达120 ℃使抗原破坏最为严重，表达效果最差；水浴修复组修复温度100 ℃和胰酶消化组修复相对较为缓和，表达效果较高温高压修复组略好；未修复组抗原未受破坏，表达效果最好。

综上所述，抗原修复方法应用是否得当，直接影响抗体的表达效果，影响病理诊断的准确性。不同抗原具有各自最佳抗原修复条件，没有一种抗原修复方法适合所有抗原。对于大多数抗原一般提倡热修复法，但对于某些特殊抗原如HBcAg作用有限，甚至起反作用。因此，合理选择抗原修复方法需要在实际操作过程中反复摸索、不断完善。

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福建医科大学附属协和医院病理科，福州 350001

黄建平，男，主管技师。E-mail： 45678197@qq.com

时间：2017-5-17 23:54 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.027.html

R 392.3

B

1001-7399(2017)05-0577-02

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.027

接受日期：2017-03-26