杏仁核脑区硫化氢对创伤后应激障碍模型大鼠抑郁样行为的影响*

刘红霞， 潘 虹， 王 华， 蒋淑君， 曹 璋， 辛文妤

(滨州医学院 1基础医学院生理学教研室， 2病理学教研室， 3药理学教研室， 山东 烟台 264003)

杏仁核脑区硫化氢对创伤后应激障碍模型大鼠抑郁样行为的影响*

刘红霞1△， 潘 虹1， 王 华1， 蒋淑君1， 曹 璋2， 辛文妤3

(滨州医学院1基础医学院生理学教研室，2病理学教研室，3药理学教研室， 山东 烟台 264003)

目的： 探讨创伤后应激障碍(posttraumatic stress disorder，PTSD)大鼠抑郁样行为改变及杏仁核内胱硫醚β-合成酶(cystathionine β-synthase, CBS)/硫化氢(hydrogen sulfide,H2S) 水平的变化，并研究补充H2S对大鼠抑郁样行为的作用及机制。方法: 应用连续单一应激方案制备PTSD动物模型，用强迫游泳实验和糖水偏好实验检测大鼠抑郁样行为，用Western blot技术和亚甲基蓝法检测杏仁核CBS/H2S 体系含量，用整体细胞外电生理方法记录杏仁核神经元放电情况。结果: 与正常对照组比较，PTSD组大鼠强迫游泳不动时间显著延长(P<0.01)，糖水偏好率显著降低(P<0.01)；杏仁核脑区的CBS/H2S 体系含量显著降低(P<0.01)。与PTSD组比较，PTSD+硫氢化钠组大鼠强迫游泳不动时间显著减少(P<0.01)，糖水偏好率显著升高(P<0.01)。微量压力注射L-半胱氨酸使杏仁核神经元自发放电频率显著升高(P<0.01)。结论: PTSD大鼠通过抑制杏仁核CBS/H2S 体系导致抑郁样行为加重。H2S拮抗PTSD大鼠抑郁样行为的机制可能与其增加杏仁核神经元放电频率和兴奋性有关。

硫化氢； 创伤后应激障碍； 胱硫醚β-合成酶； 杏仁核

暴力事件、自然灾害和重大交通事故等意外事件可导致亲身经历者和目击者罹患创伤后应激障碍(posttraumatic stress disorder，PTSD)，防治本病已成为全球普遍关注的医学和社会问题。PTSD发病机制多样，杏仁核可能是影响PTSD症状的关键核团，在条件性恐惧的获得、表达和消退中具有关键作用[1]；人类脑成像研究表明PTSD患者杏仁核活动增强[2]，可能是PTSD患者条件性恐惧不易消退的原因；海马-杏仁核特别是杏仁核基底外侧核(basolate-ral amygdala，BLA)神经环路突触效能的长时程增强(long-term potentiation，LTP)可能是条件性恐惧和应激所致焦虑的神经基础[3]。目前没有特效药治疗该病，主要有抗抑郁药和心理治疗，因此探究PTSD的神经生物学机制寻找治疗靶点具有重要意义。脑内硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)有多种神经调控功能，可参与学习记忆和情绪调节。H2S选择性上调含NR2B亚基的N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid, NMDA)受体功能，参与杏仁核介导的条件恐惧情感记忆行为；外源性H2S增强杏仁核依赖的情感记忆，减缓记忆的遗忘[4]。而PTSD患者的临床症状中就有条件性恐惧行为和学习记忆能力下降。那么硫化氢是否影响PTSD患者的抑郁样行为？其机制如何？我们应用连续单一应激方案制备PTSD大鼠模型，用强迫游泳实验和糖水偏好实验检测大鼠抑郁样行为，用Western blot技术和亚甲基蓝法检测杏仁核的胱硫醚β-合成酶(cystathionine β-synthase, CBS)/H2S体系含量，用整体细胞外电生理方法记录杏仁核神经元放电情况，对以上问题进行研究。

材 料 和 方 法

1 实验动物及给药

成年健康雄性Wistar大鼠，体质量200～300 g，青岛市药检所动物中心提供，大鼠实验前适应实验室环境1周。造模后第14天检测行为学指标。治疗组于造模前0.5 h及行为学测试前0.5 h分别腹腔注射11.2 mg/kg 硫氢化钠(sodium hydrosulfide, NaHS)。正常对照组(normal组)和PTSD组腹腔注射等剂量生理盐水。

2 主要药品和仪器

CBS抗体购自Santa Cruz; NaHS和滂胺天蓝购自Sigma; Micro1401数据采集系统和Spike2数据分析系统购自CED。

3 主要方法

3.1 制备PTSD模型 采用连续单一应激(single prolonged stress，SPS)方案制备大鼠PTSD模型，将大鼠连续进行下述处理：禁锢2 h；强迫性游泳20 min(水温25 ℃，水深40 cm)；休息15 min后乙醚麻醉，意识丧失后停止麻醉。

3.2 大鼠强迫游泳实验 将单只大鼠置于游泳圆筒内(筒高70 cm, 内径30 cm, 水面高度35 cm, 水温23～25 ℃)，游泳6 min，前2 min作为大鼠适应阶段，后4 min记录不动状态的时间。每只大鼠更换1次游泳用水，避免重复用水对测试大鼠产生影响。用漂浮不动时间作为判断大鼠抑郁严重程度的指标，不动时间越长，表示大鼠绝望状态越严重，抑郁样行为越严重。

3.3 大鼠糖水偏好实验 训练期间，大鼠单笼饲养，每笼配备2瓶水，1瓶饮用水，1瓶1%蔗糖水溶液，适应该状态48 h，每12 h对调2个水瓶位置，用以消除大鼠的饮水位置偏好。测试前禁食禁水12 h开始，将饮用水、1%蔗糖水溶液放回原位，让大鼠自由饮水1 h，分别计算出各水瓶消耗量。计算糖水偏好率(%)：蔗糖水饮用体积/总饮用体积×100%。糖水偏好率值越低，表示大鼠快感缺失，具有抑郁倾向。

3.4 硫化氢含量检测 脑组织的H2S含量用亚甲蓝法进行检测[5]。大鼠麻醉后断头，冰上取双侧杏仁核，称重-80 ℃冰箱备用。在冷的磷酸氢钾缓冲液(pH 7.4)中将脑组织匀浆裂解(每mg组织加10 μL 缓冲液)。200 μL 组织裂解上清与1% 醋酸锌生成硫化锌沉淀，20 000×g离心力离心15 min，将沉淀用溶于7.2 mol/L盐酸的N,N-二甲基对苯二胺硫酸盐(20 mmol/L)150 μL 和溶于1.2 mol/L盐酸的FeCl3(30 mmol/L)100 μL 液体进行溶解。静置15 min，将200 μL转移到96孔板中用670 nm 波长行吸光度检测。配制NaHS浓度标准曲线和吸光度(A)值，计算样品H2S含量。为防止H2S与玻璃结合，整个实验采用聚丙烯塑料管为容器。

3.5 Western blot方法检测脑组织CBS蛋白的表达 大鼠麻醉后断头，冰上取出双侧杏仁核，称重后-80 ℃冰箱备用。提取组织总蛋白并BCA法行蛋白定量，加入上样缓冲液，95 ℃加热5 min，冻存于-80 ℃冰箱备用。进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，各泳道加入的样品蛋白总量为40 μg。电泳将蛋白分离，湿转法将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移至PVDF膜上。TBST配制的5%脱脂奶粉室温振摇1 h，加 I 抗 (CBS多克隆抗体，1∶2 000)4 ℃过夜，HRP标记的山羊抗兔IgG II 抗(1∶2 000)室温2 h，并分别洗涤，ECL显色后暗室中压片、显影、定影，扫描后用 ImageJ软件分析各条带的灰度值。

3.6 电生理学方法 体质量200～300 g的健康雄性Wistar大鼠，腹腔注射20%乌来糖(1 g/kg)进行麻醉。大鼠俯卧位固定于脑立体定位仪上，参照大鼠脑图谱(Paxinos & Watson， 2005)定位，BLA区坐标如下：前囟向后2.8 mm，中线旁开4.5 mm，向下7.5～9.0 mm。液压推进器将三管玻璃微电极送至杏仁核，观察细胞放电平稳5 min，用PM2000B型四道压力注射仪通过气体压力(1 500 ms, 5.0～15.0 psi)将药物注射到神经元表面，用Spike2数据分析系统对细胞放电频率进行分析，通过Micro1401数据采集系统显示细胞放电曲线。将加药后反应高峰50 s内平均每秒放电频率作为药物的效应，以加药前120 s内平均每秒放电频率为对照。

4 统计学处理

用SPSS 18.0软件进行统计分析。作图采用SigmaPlot 10.0。计量数据采用均数±标准误(mean±SEM)表示，采用t检验或单因素方差分析(两两比较行Bonferroni校正的t检验)分析不同组间的差别，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 SPS方案制备PTSD动物模型后，大鼠抑郁样行为加重，杏仁核CBS/H2S体系生成减少

采用强迫游泳实验检测大鼠抑郁行为，结果如图1所示，与正常对照组比较，PTSD组大鼠强迫游泳不动时间显著延长(P<0.01)。

Figure 1.The immobility time of forced swimming test in normal group and PTSD group. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsnormal group.

图1 造模前后大鼠强迫游泳实验中不动时间的比较

采用糖水偏好实验检测大鼠抑郁行为，结果如图2所示，与正常对照组比较，PTSD组大鼠糖水偏好率显著降低(P<0.01)。

如图3所示，与正常对照组相比，PTSD大鼠杏仁核脑区的H2S含量显著降低(P<0.01)。

如图4所示，PTSD大鼠海马脑区CBS的表达水平明显下降(P<0.05)。

2 H2S供体NaHS可改善PTSD大鼠抑郁样行为

与PTSD组比较，PTSD+NaHS组大鼠强迫游泳不动时间显著减少(P<0.01)，见图5A。与PTSD组比较，PTSD+NaHS组大鼠糖水偏好率显著增加(P<0.01)，见图5B。强迫游泳实验及糖水偏好实验结果提示H2S改善PTSD大鼠抑郁样行为。

Figure 2.The sucrose preference in sucrose preference test in normal group and PTSD group. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsnormal group.

图2 造模前后大鼠糖水偏好实验中糖水偏好率的比较

Figure 3.The H2S level in the amygdala tissues of normal group and PTSD group. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsnormal group.

图3 造模前后大鼠杏仁核组织内源性H2S含量比较

Figure 4.The CBS level in the amygdala tissues in normal group and PTSD group. Mean±SEM.n=4.##P<0.01vsnormal group.

图4 造模前后大鼠杏仁核组织CBS含量的比较

Figure 5.The immobility time in forced swimming test (A) and the sucrose preference in sucrose preference test (B) in different groups. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsnormal group；**P<0.01vsPTSD group.

图5 各组大鼠强迫游泳不动时间和糖水偏好实验中糖水偏好率的比较

3 H2S供体L-cysteine对正常大鼠杏仁核神经元细胞外放电的影响

用多管微电极细胞外电生理记录方法观察L-cysteine对大鼠整体状态下杏仁核神经元放电频率的影响，结果如图6所示。微量压力注射无菌生理盐水前后杏仁核神经元的放电频率差别无统计学显著性；注射L-cysteine后杏仁核神经元自发放电频率显著升高(P<0.01)。

Figure 6.The effects of H2S system on the frequency of spontaneous discharges of amygdala neurons. A: initial graph of the frequency of spontaneous discharges of amygdala neurons; B: the quantitative analysis of saline on firing rate； C: the quantitative analysis of L-cysteine on firing rate. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsbefore.

图6 L-cysteine对正常大鼠杏仁核神经元放电频率的影响

讨 论

PTSD是个体经历威胁性或灾难性心理创伤后，精神症状延迟出现和长期存在的精神障碍，患者有强烈的恐惧和惊吓反应。本研究选取的SPS动物模型是PTSD行为敏感化常用的应激模式，能够模仿人类严重创伤事件后长期的生理改变和行为改变等关键特征，主要模拟了PTSD患者对创伤线索的惊吓反应增强。强迫游泳实验和糖水偏好实验可作为动物抑郁程度的客观评价指标。本研究采用SPS方案制备PTSD动物模型，采用强迫游泳实验中不动时间和糖水偏好实验来检测大鼠抑郁样行为。实验结果显示，与正常对照组比较，PTSD组大鼠强迫游泳实验中不动时间显著延长，糖水偏好实验中糖水偏好率显著降低，提示PTSD模型大鼠表现出抑郁样行为，这与陈云春等[6]研究结果一致，提示SPS方案制备的PTSD动物模型可成功模仿人类的抑郁状态。

杏仁核的主要功能是产生与外界信息相适应的情绪行为，调控情绪学习和记忆[7]。其中杏仁核基底外侧复核和中央核被认为是恐惧学习和记忆中重要的中枢。杏仁核功能失调可导致患者或动物出现异常的情感行为和情感功能障碍[8]。PTSD患者和动物的研究表明杏仁核、海马与内侧前额叶皮层在PTSD相关症状中具有重要作用；杏仁核可能是影响PTSD症状的关键核团，在条件性恐惧的获得、表达和消退中具有关键作用[1]；人类脑成像研究表明PTSD患者的杏仁核活动增强[2]，这可能是PTSD患者条件性恐惧不易消退的原因。故我们研究了PTSD模型大鼠与杏仁核相关的行为学变化和机制。

气体信号分子H2S在脑内含量较高(50～160 μmol/L)，对缺氧诱导的皮层神经元损伤有保护作用[9]，硫化氢参与学习记忆和情绪调节。研究证实H2S选择性上调含NR2B亚基的NMDA受体的功能进而调节杏仁核介导的条件恐惧情感记忆行为，外源性H2S可增强杏仁核依赖的情感记忆，并减缓记忆的遗忘[4]。CBS是大脑合成H2S的关键酶，免疫组化结果显示杏仁核表达大量的CBS，主要表达于星形胶质细胞[10]。杏仁核内注射CBS抑制剂可损伤大鼠线索型恐惧记忆，表明胶质细胞源性H2S是杏仁核相关情感记忆所必需的。我们的实验结果显示PTSD大鼠杏仁核脑区CBS的表达和H2S的生成均显著低于正常对照组，提示杏仁核脑区CBS/H2S体系受抑制可能与PTSD患者的抑郁样行为相关。侯晓怡[11]报道了外源性补充H2S对急、慢性应激导致的大鼠抑郁样行为均有改善作用。NaHS是较常用H2S供体，腹腔注射NaHS可以促进脑内H2S水平的升高[5]。故本研究通过腹腔注射NaHS研究H2S对PTSD大鼠抑郁样行为的影响。实验结果显示NaHS治疗明显改善了PTSD大鼠的抑郁样行为。这些结果均提示调控脑内H2S含量可能是治疗不同病因诱发抑郁症的新策略。

杏仁核区α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid, AMPA)受体和NMDA受体等兴奋性谷氨酸受体在情感学习和记忆形成过程中扮演着重要角色[12]；H2S可抑制兴奋性氨基酸的释放，易化海马LTP[13]；电生理研究也证实了H2S选择性上调含NR2B亚基的NMDA受体的功能进而参与杏仁核介导的条件恐惧情感记忆行为，外源性H2S可增强杏仁核依赖的情感记忆，并减缓记忆的遗忘[4]。以上研究均提示硫化氢可以影响神经元的电生理特性。故本实验利用在体细胞外电生理记录法，观察H2S供体L-cysteine对大鼠杏仁核神经元电生理特性的影响。与以上文献[4, 9]报道一致，L-cysteine可以影响神经元的电生理特性，主要表现为L-cysteine对杏仁核神经元产生兴奋效应，使杏仁核神经元放电频率升高。综合文献及实验结果我们分析，增加杏仁核神经元放电频率和兴奋性可能是H2S改善PTSD大鼠抑郁样行为的机制之一。

综上所述，PTSD大鼠通过抑制杏仁核脑区CBS/H2S 体系导致抑郁样行为加重，H2S可拮抗PTSD大鼠抑郁样行为，该作用可能与其增加杏仁核神经元放电频率和兴奋性有关。该研究可为临床寻找防治创伤后应激障碍靶点提供新思路和实验依据。

[1] McLott J, Jurecic J, Hemphill L, et al. Development of an amygdalocentric neurocircuitry-reactive aggression theoretical model of emergence delirium in posttraumatic stress disorder: an integrative literature review[J]. AANA J, 2013, 81(5):379-384.

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[11]侯晓怡. 气体信号分子硫化氢对慢性不可预知性应激所致大鼠抑郁样行为的作用及机制[D]. 武汉: 华中科技大学, 2014.

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[13]Kimura H. Hydrogen sulfide induces cyclic AMP and modulates the NMDA receptor[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2000, 267(1):129-133.

(责任编辑： 卢 萍， 罗 森)

Effect of amygdala H2S system on depression-like behavior in posttraumatic stress disorder rats

LIU Hong-xia1, PAN Hong1, WANG Hua1, JIANG Shun-jun1, CAO Zhang2, XIN Wen-yu3

(1DepartmentofPhysiology,SchoolofBasicMedicalSciences,2DepartmentofPathology,3DepartmentofPharmacology,BinzhouMedicalUniversity,Yantai264003,China.E-mail:liuhongxia3210@163.com)

AIM: To explore the depression-like behavior and cystathionine β-synthase (CBS)/hydrogen sulfide (H2S) levels of amygdala in posttraumatic stress disorder (PTSD) rats and to study the effect of exogenous H2S on PTSD rats.METHODS: Single prolonged stress paradigm was adopted to prepare PTSD animal model. Forced swimming test and sucrose preference test were used to evaluate the depression-like behavior. The content of CBS/H2S in amygdala tissue was measured by Western blot and methylene blue method.Invivoextracellular single unit recordings was used to examine the frequency of spontaneous discharges of amygdala neurons. RESULTS: The immobility time in forced swimming test of PTSD group increased and sucrose preference in sucrose preference test of PTSD group decreased compare with normal group (P<0.01). CBS/H2S level in amygdala tissue of PTSD group decreased compared with normal group (P<0.01). The immobility time of the rats in forced swimming test of NaHS+PTSD group decreased and the sucrose prefe-rence in sucrose preference test of NaHS+PTSD group increased compare with PTSD group (P<0.01). L-cysteine increased the frequency of spontaneous discharges of amygdala neurons (P<0.01). CONCLUSION: Depression-like behavior is aggravated in PTSD model rats owing to the inhibition of CBS/H2S content in amygdala tissue. The mechanism of behavior-improving effect of H2S on PTSD model rats is possibly related to excitating amygdala neurons and increasing the frequency of spontaneous discharges.

Hydrogen sulfide; Posttraumatic stress disorder; Cystathionine β-synthase; Amygdala

1000- 4718(2017)06- 0988- 05

2016- 10- 19

2017- 03- 20

山东省自然科学基金资助项目(No.ZR2013HL009； No.BS2015YY036； No.BS2014YY049)；烟台市科技发展计划项目(No.2012ZH248； No.2015ZH085)

R749.5+; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.005

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 18605353909； E-mail: liuhongxia3210@163.com