一种化学诱变方法对黑曲霉发酵的影响

刘梦涵(中粮生物化学(安徽)股份有限公司， 安徽 蚌埠 233010)

一种化学诱变方法对黑曲霉发酵的影响

刘梦涵(中粮生物化学(安徽)股份有限公司， 安徽 蚌埠 233010)

经过不同浓度的抗霉素平板对菌株进行化学诱变，通过透明圈、摇瓶筛选，获得高产柠檬酸菌株。经过稳定性试验，最终确定一株稳定性好的高产菌株。

诱变;透明圈;产酸

线粒体是细胞内产生能和控制细胞凋亡的重要细胞器，被认为是细胞生存与死亡的调控中心。线粒体的膜电位及活性氧水平是衡量线粒体乃至细胞健康和损伤的关键活性参数之一。线粒体膜电位的崩溃或下降会导致腺苷三磷酸(ATP)的合成受阻，ATP酶功能逆转，使得细胞内ATP供应不足，离子稳态失衡等，最终可导致细胞损伤甚至死亡。使用抗霉素A处理细胞时，线粒体呼吸链的电子传递受到抑制，导致线粒体内活性氧的增加以及ATP能量的亏损。

抗霉素A属于电子递体抑制剂，具有抑制电子从细胞色素b到细胞色素C1传递的作用，使氧化作用不能完成，导致细胞内ATP合成受阻，同时会导致NADH不能被氧化脱氢，细胞内NADH/NAD+水平升高。细胞内的ATP浓度的下降，减轻了ATP对磷酸果糖激酶(PFK酶)的反馈抑制,使EMP代谢流量增加，丙酮酸和草酰乙酸生成水平提高，使柠檬酸大量积累，增加柠檬酸的生物合成(黑曲霉生长时EMP:HMP=2:1，产酸时EMP:HMP=4:1)。

1 萌发率试验

表1

表2

从孢子(表1)在抗性平板上的生长现象可以看出，孢子生长对抗霉素A敏感。由于抗霉素A属于电子递体抑制剂，具有抑制电子从细胞色素b到细胞色素C1传递的作用，使氧化作用不能完成，导致细胞内ATP合成受阻，同时会导致NADH不能被氧化脱氢，细胞内NADH/NAD+水平升高。在抗霉素A低浓度时可通过细胞内底物水平磷酸化作用生产ATP,供细胞生长需要。

当抗霉素A浓度大于0.3mg/L后，随着抗霉素A的浓度增加，孢子萌发率快速下降，当抗霉素A浓度为1.1mg/L时，孢子萌发率仅为1.02%。而且随着抗霉素A浓度的增加，孢子萌发时间及产孢子时间都有不同程度的推迟。所以我们确定在下一步抗性筛选中，抗性平板培养基中的抗霉素A的浓度为0.5mg/L、0.7 mg/L、0.9 mg/L。

2 透明圈筛选结果

根据萌发率试验结果，我们选择抗霉素A的浓度为0.5mg/L、0.7mg/L、0.9mg/L的PDA培养基的作为抗性筛选的培养基。抗性平板培养43.5h，挑选菌落形态较好、大小均匀的84个单菌落转移清液平板，进行透明圈筛选，每个清液平板放置3个单菌落。清液平板培养24h，测量菌落及透明圈直径。

根据菌落形态不发散(表2)，且H/C的值大于84个单菌落的H/C的平均值(2.92)这个标准，挑选29个单菌落转移小斜面，进行产孢试验。而这29个单菌落的H/C值在2.32～3.9之间，他们在正太分布图中的分布频率也较高。

3 抗性菌株摇瓶筛选

根据萌发率试验结果，我们选择抗霉素A的浓度为0.5mg/ L、0.7mg/L、0.9mg/L的PDA培养基的作为抗性筛选的培养基。抗性平板培养43.5h，挑选菌落形态较好、大小均匀的84个单菌落转移清液平板，进行透明圈筛选，每个清液平板放置3个单菌落。清液平板培养24h，测量菌落及透明圈直径。根据比值及菌落形态共挑选84个单菌落进行摇瓶筛选。抗性菌株摇瓶发酵结果如(表3)，根据摇瓶筛选结果，优选0.7A-5、0.9A-1、0.9A-3三珠菌株进行发酵性能稳定性试验。

表3

表4

4 抗性菌株稳定性试验

FC216菌种在添加抗霉素A的培养基上培养，通过清液平板筛选、摇瓶筛选，选育出能利用玉米原料快速产生柠檬酸，而不利用和分解柠檬酸的菌株，菌株的产酸性能较出发株至少提高5%，而且菌株性能稳定。菌株的稳定性是衡量一株优良菌种的重要标志，抗性菌株由于基因突变，往往失去生理特性的平衡，同时也降低了与原来环境的适应能力，所以菌株在传代过程，发酵产酸等各项性能不稳定。所以我们计划对抗性菌株进行稳定性试验。考察菌株稳定性一般需要对菌株进行传代10次，然后挑选第2、4、6、8、10代分别与第一代进行摇瓶对比试验并加以判断。

通过对摇瓶发酵结果分析，从表(四)可以看出，0.9A-1的菌株产酸偏差变化范围最小，在2.0左右，变化比较平稳。这说明该菌株随着传代次数的增加产酸性能比较稳定。0.9A-3菌株产酸偏差虽然在1.0左右，变化范围也较小，但是从第六代开始产酸偏差是负偏差，这说明该菌株性能开始向退化的方向进行，稳定性差。0.7A-5菌株产酸偏差虽然较高，但是产酸偏差变化幅度相对较大，这说明该菌株随着传代次数的增加，稳定性较差。