ERα特异性抑制剂MPP降低小鼠2-细胞胚G1/S期过渡相关因子Nanog、cyclin D1和cyclin E水平

逄丽丽，贺琳，宋婵婵，连秀丽，刘玥，许颂华，王世鄂,*

（福建医科大学基础医学院1细胞与发育工程中心，2人体解剖学与组织胚胎学系，福州 350122）

论著

ERα特异性抑制剂MPP降低小鼠2-细胞胚G1/S期过渡相关因子Nanog、cyclin D1和cyclin E水平

逄丽丽1，贺琳2，宋婵婵1，连秀丽2，刘玥1，许颂华2，王世鄂1,2*

（福建医科大学基础医学院1细胞与发育工程中心，2人体解剖学与组织胚胎学系，福州 350122）

目的观察雌激素受体（ERα）特异性抑制剂甲基哌啶吡唑（methyl-piperidino-pyrazole，MPP）对小鼠2-细胞胚G1/S期过渡相关因子Nanog、cyclin D1和cyclin E表达水平的影响，阐明ERα对小鼠2-细胞胚G1/S期过渡的作用，为进一步探讨ERα在小鼠植入前胚合子基因组激活中的作用机制提供理论依据。方法收集昆明雌性小鼠与雄性小鼠交配所得的受精卵，分别置于无MPP的培养液和含20μmol/L MPP的培养液中培养，获取体外发育的2-细胞胚，采用免疫荧光染色技术检测细胞内Nanog、cyclin D1和cyclin E水平。结果免疫荧光染色结果显示，含20μmol/L MPP培养液培养的受精卵其体外发育2-细胞胚内Nanog、cyclin D1和cyclin E免疫反应性明显降低。结论ERα可通过调控小鼠2-细胞胚内Nanog、cyclinD1和cyclinE水平，影响细胞从G1期到S期的过渡。

雌激素受体α；植入前胚；Nanog；细胞周期蛋白；小鼠

雌激素受体α（estrogen receptor alpha, ERα）是类固醇激素受体超家族成员之一，可通过经典及非经典途径调控基因表达，对细胞与组织的增殖、分化和发育起着重要作用[1]。前期研究发现，ERα对小鼠植入前胚体外发育有一定的作用，经ERα特异性抑制剂甲基哌啶吡唑（methyl-piperidino-pyrazole，MPP）处理后，小鼠植入前胚发育停滞在2-细胞胚时期，且合子基因组激活（zygotic gene activation, ZGA）相关基因MuERV-L mRNA表达水平下调[2]。ERα的时空动态表达模式也提示，ERα可能调控小鼠植入前胚第一次卵裂的细胞周期进程，参与ZGA[3]。进一步研究发现，经MPP作用后，小鼠2-细胞胚核呈较小的圆形核，属于G0/G1期细胞核象，提示MPP处理后小鼠2-细胞胚（hCG后42h）发育阻滞于DNA复制前期。BrdU标记实验显示，ERα在小鼠2-细胞胚S期中的作用与S期启动有关[4]。但ERα是否通过调节2-细胞胚G1/S期监测点相关蛋白的表达来影响后续发育进程尚不明了。

研究表明，参与G1/S期过渡的关键蛋白主要有cyclinD和cyclinE等。脊椎动物G1期的细胞周期素主要有cyclin D1、cyclin D2和cyclin D3，但它们的含量变化并不依赖于细胞周期进程，而主要依赖于细胞生长或生长促进信号[5]。无论是在正常细胞中，还是在肿瘤细胞中，若cyclin D1蛋白表达受到抑制，则细胞周期停滞在G1/S期，无法顺利过渡到后续发育阶段[6-8]。G1/S期的另一重要调控因子Cyclin E的角色则更加复杂，cyclin D1-细胞周期依赖性蛋白激酶（CDK）4/6只催化部分pRB的磷酸化和E2F的激活，而cyclin E-CDK2可促使E2F完全激活，并通过pRB蛋白的磷酸化，对E2F依赖的基因表达起主要的协调作用[9]。大多哺乳动物细胞中DNA的复制由S期CDKs启动，cyclin E-CDk2复合物作为复制起始的直接调控者引起S期CDKs抑制蛋白的酶解[10]。此外，胚胎干细胞转录因子Nanog对细胞周期的推动也有重要作用。Nanog能推动高分化的小鼠胚胎干细胞G1/S期过渡[11]，也可通过调控下游的CDK6及CDC25A，推动细胞由G1期进入S期[12]。可见，Nanog可作用于细胞周期关键调控因子，参与G1/S期的过渡。本研究通过免疫荧光染色技术检测MPP处理后小鼠2-细胞胚中Nanog及细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin E的表达情况，进一步阐明ERα在小鼠植入前胚G1/S期过渡中的作用机制。

材料和方法

1 实验动物

昆明（kunming，KM）小鼠购自上海斯莱克公司，雌鼠4～6周，雄鼠8周以上，继续饲养3～5d调节生理周期，使其适应环境供实验处理。

2 主要试剂和仪器

孕马血清促性腺激素（PMSG）（宁波激素制药二厂），人绒毛膜促性腺激素（hCG）（Prospec公司），ERα特异性抑制剂（MPP）（Tocris Bioscience），Nanog兔多克隆抗体（Cell Signaling Technology），cyclin D1鼠单克隆抗体（武汉博士德），cyclin E兔多克隆抗体（Santa Cruz），Alexa Fluor® 488标记驴抗鼠二抗、Alexa Fluor® 488标记驴抗兔二抗（Life Technology），DAPI（碧云天），倒置显微镜（Nikon），水套式二氧化碳培养箱（Thermo）。

3 胚胎的收集和培养

KM雌性小鼠腹腔注射10IU PMSG，46～48h后注射10IU hCG，随后与KM雄性小鼠1∶1合笼（♀KM×♂KM），次日清晨检查阴栓判断是否受精。在注射hCG后27h，从有阴栓雌鼠输卵管中收集受精卵，经M2洗涤，37℃、5% CO2平衡的potassium-supplemented simplex optimized medium (KSOM)漂洗3次，将形态完好的受精卵移至预孵育好的培养液滴（其中分别含0μmol/L、20μmol/L的MPP）中，置于37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中连续培养，每天观察和记录植入前胚发育情况，重复3次以上，确认20μmol/L MPP使1-细胞胚体外发育阻滞于2-细胞期。

4 免疫荧光染色

收集hCG注射后27h的1-细胞胚，分别置于KSOM和含MPP（20μmol/L）KSOM培养液中培养18h获取2-细胞胚，经固定、通透、封闭、一抗（Nanog兔多抗1∶800；cyclin D1鼠单抗 1∶400；cyclin E兔多抗1∶3200）4℃孵育过夜；二抗（Alexa Fluor 488标记驴抗兔1∶1000；Alexa Fluor® 488标记驴抗鼠1∶1000）孵育、DAPI复染，倒置荧光显微镜观察、拍照，所得图片用SmartScape软件进行荧光强度分析。

5 统计学处理

利用SmartScape软件计算免疫荧光图片中各组2-细胞胚内荧光灰度值，采用SPSS17.0统计软件对实验数据进行统计分析，检验方差齐性后运用独立样本t检验进行组间比较，均以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

图1 MPP对2-细胞胚内Nanog影响的免疫荧光检测。A，Nanog免疫反应性荧光显微镜成像；B，Nanog免疫反应性统计学分析；比例尺，50μm；**，与对照组比较，P＜0.01。Fig. 1 Immunofuorescent detection of the efect of MPP on Nanog expression in 2-cell embryos. A, fuorescence microscope images of Nanog immunoreactivity; B, statistical analysis of Nanog immunoreactivity; scale bar, 50μm; **, P＜0.01, compared with control

图2 MPP对2-细胞胚内cyclin D1影响的免疫荧光检测。A，cyclin D1免疫反应性荧光显微镜成像；B，Nanog免疫反应性统计学分析；比例尺，50μm；**，与对照组比较，P＜0.01。Fig. 2 Immunofuorescent detection of the efect of MPP on cyclin D1 expression in 2-cell embryos. A, fuorescence microscope images of cyclin D1 immunoreactivity; B, statistical analysis of cyclin D1 immunoreactivity; scale bar, 50μm; **, P＜0.01, compared with control

图3 MPP对2-细胞胚内cyclin E影响的免疫荧光检测。A，cyclin E免疫反应性荧光显微镜成像；B，cyclin E免疫反应性统计学分析；比例尺，50μm；**，与对照组比较，P＜0.01。Fig. 3 Immunofuorescent detection of the efect of MPP on cyclin E expression in 2-cell embryos. A, fuorescence microscope images of cyclin E immunoreactivity; B, statistical analysis of cyclin E immunoreactivity; scale bar, 50μm; **, P＜0.01, compared with control

免疫荧光染色观察显示，Nanog、cyclin D1和Cyclin E免疫反应性在2-细胞胚的胞质和胞核均有分布（图1A，图2A，图3A）。三者在无MPPKSOM培养的2-细胞胚内核定位更为明显（图1A上行，图2A上行，图3A上行）；经MPP处理后，三者在2-细胞胚核内和细胞整体的水平均显著降低（图1A下行，图2A下行，图3A下行，图1B，图2B，图3B）。

讨 论

前期研究表明，ERα特异性抑制剂MPP可抑制小鼠合子型标志基因的表达[2]，ERα可能通过调节2-细胞胚“G1/S期检测点”相关蛋白的功能，影响小鼠2-细胞胚G1/S期过渡，进而调控ZGA的发生，以及后续的早胚发育进程[4]。Nanog最早被发现作为转录因子，对胚胎干细胞全能性的维持有重要作用，后期另有大量研究发现其对细胞周期调控，尤其是G1/S期过渡亦有重要作用。Nanog表达水平的改变可影响细胞周期关键调节因子的表达，从而影响细胞从G1期到S期的过渡。有研究发现，Nanog的C端可结合于CDK6和CDC25A的调控区，从而推动人胚胎干细胞顺利由G1期进入S期[12]。Nanog可与Oct4、Sox2协同作用，通过影响小分子非编码RNA的表达，调控细胞周期：三者共同结合于miR-302的启动子区域，减少G1期细胞数，增加S期细胞数，促进细胞进入S期[13]。Tomonori等人提出CIBZ可通过PI3K信号调控Nanog表达水平，从而促进人胚胎干细胞G1/S期的进程[11]。本研究发现，经ERα特异性抑制剂MPP（20μmol/L）处理后，小鼠植入前胚发育阻滞在2-细胞阶段， Nanog水平降低，提示ERα可能影响小鼠2-细胞胚中Nanog表达。

此外，cyclin D1作为G1/S期特异性周期蛋白，推动细胞周期进程，促进细胞的增殖。真核生物细胞周期调节存在“开关”样的调控模式，细胞周期依赖性蛋白激酶（CDKs）作为细胞周期的“按钮”持续存在于细胞中，其活性受到相应细胞周期蛋白（cyclins）的严格调控，只有当细胞周期蛋白表达量到达一定阈值时方可激活CDKs，从而推动细胞周期进程[14]。Cyclin D1通过结合并激活G1期CDK4/6，使G1期的抑制蛋白Rb磷酸化失活，与转录因子E2F解离，E2F转录因子启动转录相关基因，从而推动细胞周期由G1期进入S期[15-17]。本研究显示，hCG后45h体外正常发育小鼠2-细胞胚核增大，大部分呈蚕豆形核象，此时处于小鼠植入前胚第二轮细胞周期的G1/S期的关键调控时期，核内cyclin D1水平正常，从而顺利完成CDK4/6激活，使2-细胞胚顺利过渡到S期、G2期，启动ZGA，克服“2-细胞阻滞”，完成后续发育。而MPP（20μmol/L）处理后，小鼠2-细胞胚核则呈较小类圆形G0/G1期细胞核象，cyclin D1明显减少，2-细胞胚发育停滞在第二轮细胞周期G0/G1期，而无法完成后续的植入前胚发育进程。

G1/S期的Start检验点，是真核生物检验细胞是否做好遗传物质复制的一个重要检验点，一旦通过Start点则标志着细胞周期不可逆地开启[18]。Start检验点的中心事件是G1/S期周期蛋白cyclin E-CDk2复合物的激活。动物细胞在Start检验点进入细胞周期为G1-、G1/S-、S-Cdks复合物的激活所触发，同时还伴随E2F依赖的基因表达激活[19,20]。研究发现，cyclin E主要在G1末期表达，在S期表达量达高峰，以保证G1/S期的顺利过渡以及S期的维持。Cyclin E-CDk2复合物参与维持Rb、Cdc6、NPAT以及核仁磷酸蛋白的高磷酸化状态，并且在G1/S期磷酸化P27，诱导其降解，促进G1/S的过渡、S期DNA复制以及细胞增殖[21,22]。以上研究表明，cyclin E蛋白表达量的高低对CDK2的激活，G1-、G1/S-、S-Cdks复合物的形成，G1期到S期的顺利过渡，以及S期遗传物质复制的维持等有重要作用。本研究发现，MPP处理后，小鼠2-细胞胚cyclin E水平也明显下降。这些结果表明，除了Nanog和cyclin D1外，cyclin E也参与ERα在小鼠2-细胞胚中的调控作用。

由此可见，ERα可通过调控小鼠2-细胞胚内Nanog、cyclin D1和cyclin E蛋白的表达水平，而影响细胞从G1期到S期的过渡。但在肝癌细胞中，敲低Nanog可导致Cyclin D1水平下调，阻滞在G0/G1期的细胞比率增高，而S期与G2期细胞明显减少[23]。那么ERα是否通过影响Nanog的蛋白表达，从而调控Cyclin D1、Cyclin E的表达水平，有待进一步研究探讨。

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Estrogen receptor α specific antagonist MPP inhibits G1/S transitionrelated factors Nanog, cyclin D1 and cyclin E in mouse 2-cell embryos

Pang Lili1, He Lin2, Song Chanchan1, Lian Xiuli2, Liu Yue1, Xu Songhua2, Wang Shie1,2*(1Cellular and Developmental Engineering Center,2Department of Human Anatomy, Histology and Embryology, School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, Fuzhou 350122, China)

ObjectiveTo investigate the efect of estrogen receptor α (ERα) specifc antagonist methyl-piperidino-pyrazole (MPP) on the expression of G1/S transition-related factors Nanog, cyclin D1 and cyclin E in mouse 2-cell embryos, so as to demonstrate the role of ERα in G1/S transition in mouse 2-cell embryos and provide a theoretical basis for further research on the mechanism of the activation of pre-implantation mouse zygotic genome by ERα.MethodsZygotes were collected from Kunming female mice that had been mated with male mice, and cultured in media without MPP and media supplemented with 20mol/L MPP, respectively. The 2-cell embryos were obtained, and the levels of Nanog, cyclin D1 and cyclin E were detected by immunofuorescent staining.ResultsImmunofuorescent staining results showed that the immunoreactivity of Nanog, cyclin D1 and cyclin E in the 2-cell embryos cultured in 20mol/L MPP was obviously lower than in those cultured without MPP treatment.ConclusionERα might afect G1/S transition via regulating the expression of Nanog, cyclin D1 and cyclin E in mouse 2-cell embryos.

Estrogen receptor alpha; pre-implantation embryo; Nanog; cyclin; mouse

R321

A

10.16705/ j. cnki. 1004-1850.2017.02.002

2017-01-17

2017-03-30

国家自然科学基金（81170624、81671526）

逄丽丽，女（1980年），汉族，实验师

*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：shineww@163.com