回医扎里奴思方对痰热腑实证脑缺血再灌注大鼠脑内细胞间黏附分子1和血管间黏附分子1表达的影响

刘 超 刘敬霞 田文荣 刘抒雯 甘佳乐 顾玉宝 王 枫

(宁夏医科大学，宁夏 银川 750004)

回医扎里奴思方对痰热腑实证脑缺血再灌注大鼠脑内细胞间黏附分子1和血管间黏附分子1表达的影响

刘 超 刘敬霞1田文荣 刘抒雯 甘佳乐 顾玉宝 王 枫

(宁夏医科大学，宁夏 银川 750004)

目的 探讨扎里奴思方对痰热腑实证脑缺血再灌注大鼠脑内细胞间黏附分子(ICAM)-1和血管间黏附分子(VCAM)-1表达的影响。方法 将60只雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组、扎里奴思方组，每组15只；除假手术组外，其余各组均给予高脂喂养4 w后，予10%的自体粪便1 ml/100 g灌胃，1次/d，连续3 d，造成痰热腑实证模型，再采用线栓法制备大脑中动脉阻塞(MCAO)模型；大鼠给药剂量尼莫地平组10.8 mg/kg、扎里奴思方组1.54 g/ml，制备MCAO模型前3 d灌胃给药。大鼠分别于缺血再灌注后1、3、7 d取脑，取材前进行脑组织含水量测定，采用免疫组化法检测缺血侧海马区ICAM-1、VCAM-1的表达,RT-PCR检测ICAM-1 mRNA和VCAM-1 mRNA的表达。结果 与假手术组比较，模型组脑组织含水量增高(P<0.01);ICAM-1、VCAM-1阳性细胞，ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA表达明显增高(P<0.01)。与模型组比较，尼莫地平组和扎里奴思方组脑组织含水量降低；ICAM-1、VCAM-1阳性细胞数减少，ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA表达降低(P<0.01)。与尼莫地平组比较，扎里奴思方7 d组脑组织含水量降低，ICAM-1、VCAM-1阳性细胞数减少，ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA表达降低(P<0.05)。结论 扎里奴思方对痰热腑实证脑缺血再灌注大鼠脑神经元起保护作用，其机制可能与抑制大鼠脑内ICAM-1和VCAM-1的表达有关。

扎里奴思方；脑缺血再灌注；痰热腑实证；细胞间黏附分子1；血管间黏附分子1

脑梗死发生是一个复杂的快速级联反应，其病理机制主要有氧自由基的产生、能量代谢障碍、钙离子超载、炎性细胞浸润等诸多环节〔1，2〕，其中炎症反应促进了脑缺血损伤的发展，是脑和神经损伤的主要病理机制之一〔3〕。细胞间黏附分子(ICAM)-1和血管间黏附分子(VCAM)-1属于免疫球蛋白超家族，是重要的炎症因子，在炎性细胞因子和细菌内毒素的刺激下可在内皮细胞表面表达，介导白细胞的黏附和渗出，从而加剧脑缺血再灌注损伤〔4〕。脑缺血后ICAM-1和VCAM-1生成增多，促进白细胞向脑梗死区浸润，而再灌注会加剧白细胞往梗死区迁移，加重炎性反应性损伤〔5〕。《回回药方》中扎里奴思方具有芳香开窍、补肾益髓、化痰祛瘀之功，对缺血再灌注大鼠具有调控血脑屏障、抗脑缺血损伤和保护脑神经元等作用〔6〕。本研究从脑缺血再灌注损伤后大鼠脑组织含水量、ICAM-1和VCAM-1表达等方面探讨扎里奴思方对脑缺血后神经元的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SD雄性大鼠，SPF级，3～4月龄，体重(300±50)g，宁夏医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(宁)2014-0001。饲养于宁夏医科大学实验动物中心，温度(25±1)℃，湿度(50±10)%，自由觅食饮水，适应性饲养7 d后进行实验。

1.2 实验药物

1.2.1 扎里奴思方 组成：海狗肾(腽肭脐)12 g、安息香(阿你松)3 g、水龙骨(伯思八牙)12 g、肉桂(萨底知)12 g、菟丝子(阿夫忒蒙)12 g、石菖蒲(哈咱卜咱里刺)12 g、小茴香(法理公)12 g、乳香(兀沙吉)12 g、当归(法忒刺撒里荣)12 g、没药(木里叶)12 g、怀牛膝(干祖伐)24 g、番红花(撒法郎)12 g、芦荟(拆不牙刺)12 g、牡丹皮12 g。由宁夏医科大学附属回医中医院提供制备。

1.2.2 尼莫地平片 规格30 mg/片，山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司。将尼莫地平研磨成细小的粉末状，加入适量的生理盐水混匀(1.08 mg/ml)灌胃。

1.2.3 高脂饲料〔7〕3%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.12%丙硫氧嘧啶、2%吐温-80、10%猪油、84.38%基础饲料。

1.3 主要试剂和仪器 蒸馏水(宁夏医科大学实验动物中心)；胆固醇(郑州兴昌化工产品有限公司，批号：67784)；1，2-丙二醇(重庆博洋生物技术有限公司，批号：57854)；吐温-80(重庆博洋生物技术有限公司)；猪油(自己购买)；TaKaRa RNA PCR试剂盒(TaKaRa公司)；水合氯醛(上海山浦化工有限公司)；A4尼龙栓线(重庆博洋生物技术有限公司，批号：2832-A4)；多聚甲醛(重庆博洋生物技术有限公司)；兔二抗及二氨基联苯胺(DAB)显色剂；电子天平(BT224S，Sartorius公司)。

1.4 分组与用药 将60只雄性大鼠按随机数字表法分为假手术组，模型组(痰热腑实证脑缺血组)，尼莫地平组，扎里奴思方组，15只/组。除假手术组外，其他各组高脂饲料喂养4 w后给予10%自体粪便1 ml/100 g灌胃3 d，然后每组随机抽选3只大鼠，腹主动脉采血，检测大鼠血脂，若血脂出现异常为痰热腑实证模型造模成功。然后制备局灶性大脑中动脉阻塞(MCAO)模型。假手术组、模型组给予生理盐水灌胃，药物治疗组分别用相应药物灌胃。大鼠用药量根据生药材含量按等效剂量换算关系，灌胃体积为1 ml/100 g，扎里奴思方为1.54 g/ml，尼莫地平10.8 mg/kg。大鼠术后每日用药1次，术前12 h禁食不禁水。

1.5 局灶性脑缺血再灌注模型制作 参照Longa等〔8〕报道的线栓法制备MCAO模型。体积分数10%水合氯醛(300 mg/kg，灌胃)麻醉大鼠，置于试验台仰卧位固定，常规去毛消毒，取颈前正中切口，分离左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉；结扎颈外动脉近心端和远心端；于颈外动脉近颈总动脉分叉处用眼科剪剪一小口，将线栓穿入颈内动脉并向前推，线栓插入深度约(18.0±0.5)mm；插线成功后留出线栓约1 cm，结扎颈外动脉剪口处，缝合皮肤。术后2 h拔出线栓进行再灌注处理。假手术组只分离血管，不结扎，不插线栓。手术过程中保持大鼠肛温(37.0±0.5)℃，保持室温(26±1)℃。

1.6 指标检测

1.6.1 脑组织含水量测定 各组大鼠断头取左侧缺血脑组织。首先电子天平称湿重，然后将脑组织放入恒温烤箱内烘干至恒重，称取干重。根据Elliot公式计算，脑含水量%=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.6.2 免疫组织化学法检测ICAM-1和VCAM-1表达 采用链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)免疫组织化学染色法检测ICAM-1和VCAM-1在缺血海马区的蛋白表达情况。按照试剂盒提供的实验步骤操作：各组大鼠按规定时间灌注后取脑，石蜡包埋脱水，3%H2O2室温10 min以灭活内源性酶；微波炉加热至沸腾，热修复抗原；滴加封闭液，室温30 min；滴加1∶100工作浓度的一抗，4℃过夜；滴加二抗，37℃孵育30 min；滴加SABC，37℃孵育30 min；DAB显色；冲洗；复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片。位于胞质或胞核内棕黄色或黄褐色颗粒为阳性表达。阳性细胞计数：在400倍光学显微镜下每张切片采用盲法随机选取5个视野，分别计数免疫反应阳性细胞数，取平均值。

1.6.3 RT-PCR法检测脑组织ICAM-1 mRNA和VCAM-1 mRNA 脑组织进行匀浆，加氯仿，离心，吸取上清液，加入异丙醇，离心，移去上清液，加入75%乙醇，清洗沉淀，离心，去除上清液，干燥RNA沉淀2～3 min，溶解RNA沉淀。使用Nanodrop2000超微量分光光度计测定A260/A280的比值，比值在1.9～2.1，计算总RNA 含量，取1 μg用于反转录。选用β-actin基因作内参照，按照2-△△Ct相对定量公式计算ICAM-1 mRNA和VCAM-1 mRNA的含量。各引物序列、产物长度见表1。取细胞总RNA 2 μl，加双蒸水2 ml，于分光光度计260 nm和280 nm处测吸光度(A)，A260/A280在1.9～2.1方可使用。反应条件，β-actin：94℃ 30 s，53.9℃ 45 s，72℃ 50 s，35个循环；ICAM-1：94℃ 30 s，53.9℃ 45 s，70℃ 50 s，34个循环；VCAM-1：94℃ 30 s，54℃ 45 s，72℃ 52 s，40个循环。

表1 引物序列

1.7 统计学方法 应用SPSS17.0软件，计量资料在比较前进行正态性及方差齐性检验，若符合正态性及方差齐性，则采用单因素方差分析，多组间两两比较用最小显著差法(LSD-t)；若不符合正态性及方差齐性，则采用秩和检验。

2 结 果

2.1 脑组织含水量 模型组与假手术组比较各时间点大鼠脑组织含水量明显增高(P<0.01)；与模型组比较，药物组大鼠各时间点脑组织含水量降低(P<0.01)；与尼莫地平组比较，扎里奴思方7 d组脑组织含水量降低(P<0.05)；与1 d组比较，尼莫地平7 d组和扎里奴思方7 d组脑组织含水量均降低(P<0.05，P<0.01)；与3 d组比较，扎里奴思方7 d组脑组织含水量降低(P<0.05)。见表2。

2.2 各组大鼠缺血侧海马区ICAM-1、VCAM-1的表达 模型组各时间点ICAM-1、VCAM-1阳性细胞表达较假手术组显著升高(P<0.05,P<0.01)；与模型组比较，尼莫地平组和扎里奴思方组ICAM-1、VCAM-1阳性细胞表达降低(P<0.05,P<0.01)；与尼莫地平组比较，扎里奴思方7 d组ICAM-1、VCAM-1阳性细胞表达降低(P<0.05)。见图1，图2，表3，表4。

2.3 对脑缺血再灌注大鼠脑组织ICAM-1 mRNA和VCAM-1 mRNA表达的影响 与假手术组比较，模型组各时间点ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA表达显著升高(P<0.01)；与模型组比较，尼莫地平组和扎里奴思方组ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA

表2 各组大鼠脑组织含水量比较

与假手术组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01；与尼莫地平组比较：3)P<0.05；与1 d组比较：4)P<0.05；与3 d组比较：5)P<0.01；下表同

图1 各组大鼠脑缺血再灌注后海马区ICAM-1 阳性细胞变化(×400)

表达显著降低(P<0.01)；与尼莫地平组比较，扎里奴思方7 d组ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA表达降低(P<0.05)。同组别不同时间点比较，尼莫地平7 d组ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA表达较1 d组降低(P<0.05)，扎里奴思方7 d组ICAM-1

表3 各组大鼠缺血侧海马区ICAM-1阳性数 细胞比较，个/视野)

表4 各组大鼠缺血侧海马区VCAM-1阳性 细胞数比较，个/视野)

图2 各组大鼠脑缺血再灌注后海马区VCAM-1 阳性细胞变化(×400)

mRNA表达较1 d组降低(P<0.05)。见表5，表6。

表5 各组大鼠脑组织ICAM-1 mRNA表达相对含量的 比较

表6 各组大鼠脑组织VCAM-1 mRNA表达相对含量的 比较

3 讨 论

《回回药方》论扎里奴思方“可开窍，净其浑身厚浊风痰，治疗痰盛弱病”，具有芳香开窍、化痰祛瘀、补肾益髓之功，是回族医学治疗缺血性脑病的常用方剂之一〔9〕。脑血管疾病的发病率逐年升高，缺血性脑血管病约占全部脑血管病的70%〔10〕。细胞黏附分子是一类能介导细胞与细胞、细胞外基质相互黏附的膜表面糖蛋白，在炎症和免疫反应等过程中起着重要的作用。在正常情况下，ICAM-1和VCAM-1很少表达或不表达，当发生脑缺血再灌注损伤时病变组织局部释放炎性因子，促使ICAM-1和VCAM-1表达明显升高，细胞间黏附性增加，造成白细胞与血管内皮细胞大量牢固黏附；白细胞可阻塞血管腔，减少血流量，进到血管外的白细胞可释放自由基、蛋白水解酶及其他毒性物质，从而加重缺血区组织损伤〔11〕。ICAM-1可介导白细胞的黏附和聚集，增强炎性因子间的瀑布反应，加重炎性损伤的程度，最终引起梗死灶面积增大〔12〕。VCAM-1参与介导细胞与细胞或细胞与基质之间黏附，其介导白细胞与血管内皮细胞黏附，穿越血脑屏障，是造成脑缺血再灌注损伤的一种重要黏附分子。Cheng等〔13〕发现抑制VCAM-1的表达能缩小缺血半暗带的范围，减轻脑缺血再灌注损伤。因此，炎症反应在缺血性损伤的病理机制中起到重要作用，参与了脑梗死的发生、发展和预后，所以下调炎性因子、阻止炎症级联反应，对神经细胞具有一定的保护作用〔14〕。

综上，扎里奴思方对痰热腑实证脑缺血再灌注大鼠脑神经元的保护作用可能与抑制脑内ICAM-1和VCAM-1表达有关。

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13 Cheng Y，Zhang HT，Sun L，etal.Involvement of cell adhesion molecules in polydatin protection of brain tissues from ischemia-reperfusion injury〔J〕.Brain Res，2006;1-110(1)：193-200.

14 周天梅，佟丽妍，张卫华.续命汤对局灶性脑缺血中风大鼠血清白介素-1β和肿瘤坏死因子-α含量的影响〔J〕.中国中医急症，2014；23(2)：246-53.

〔2016-11-15修回〕

(编辑 袁左鸣)

The effects of Hui Medicine Zhali Nusi Fang on the expressions of ICAM1 and VCAM1 in the heat-phlegm and sthenic-fu syndrome rats after cerebral ischemia-reperfusion

LIU Chao,LIU Jing-Xia,TIAN Wen-Rong,etal.

Ningxia Medical University,Yinchuan 750004, Ningxia, China

Objective To investigate the effects of Hui Medicine Zhali Nusi Fang on expressions of ICAM1 and VCAM1 in the heat-phlegm and sthenic-fu syndrome rats after cerebral ischemia-reperfusion.Methods Sixty male SD rats were randomly divided into sham model,Nimodipine and Zhalinusi Fang groups(n=15).Except sham group,the other groups were fed with high fat diet for four weeks.Next,rat stools were administered intragastrically once a day for three days to make the heat-phlegm and sthenic-fu syndrome,then focal cerebral ischemia models were established by middle cerebral artery occlusion with nylon thread.Rats were given with nimodipine(NMDP)(10.8 mg/kg),Zhali Nusi Fang(1.54 g/0.1 kg) by ig before the model preparation.The material at 1,3,7 days were obtained respectively, to determine brain water content before bringing out the rat brain.The expressions of ICAM1 and VCAM1 were observed by immunohistochemistry and RT-PCR methods.Results Compared with that of sham group,brain water content of model group rats was increased(P<0.01),the expressions of ICAM1,ICAM1 mRNA and VCAM1,VCAM1 proteins were upregulated(P<0.01).Compared with those of model groups,brain water content of ZLNSF and NMDP groups were reduced,the expressions of ICAM1,VCAM1 proteins and ICAM1,VCAM1 mRNA were decreased(P<0.01).Compared with those of NMDP group,the expressions of ICAM1,VCAM1 proteins and ICAM1,VCAM1 mRNA were decreased(P<0.05),especially the seven-day group(P<0.05).Conclusions Zhali Nusi Fang has protective effects against the heat-phlegm and sthenic-fu syndrome rats after cerebral ischemia-reperfusion,which might be related with inhibiting the expression of ICAM1 and VCAM1.

Zhali Nusi fang;Cerebral ischemia-reperfusion;Heat-phlegm andsthenic-fu syndrome;sICAM1;sVCAM1

国家十二五科技支撑项目(SQ2013SF12E02181)；国家自然科学基金资助项目(81260569)

刘敬霞(1970-)，女，博士，博士后，教授，主任医师，硕士生导师，主要从事中医药防治老年病研究。

刘 超(1991-)，男，在读硕士，主要从事中医药防治老年病研究。

R74

A

1005-9202(2017)11-2606-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.003

1 宁夏医科大学回医药现代化省部共建教育部重点实验室