复合香辛料精油配方优化及对冰温贮藏牛肉保鲜效果研究

赵玉明，田晋梅，彭晓光

（1.山西省生物研究所，山西太原 030006；2.山西省畜牧兽医学校，山西太原030024）

复合香辛料精油配方优化及对冰温贮藏牛肉保鲜效果研究

赵玉明1，田晋梅2，彭晓光1

（1.山西省生物研究所，山西太原 030006；2.山西省畜牧兽医学校，山西太原030024）

通过杯碟法研究5种香辛料（丁香、大蒜、生姜、八角、肉桂）精油对牛肉贮藏过程中的优势致腐菌热死环丝菌（Brochothrixthermosphacta）、分叉肉杆菌（Carnobacteriumdivergens）和变形斑沙雷菌（Serratiaproteamaculans）的抑菌效果，在此基础上将5种精油进行复配，通过正交试验优化香辛料精油配方。然后将最佳配方作用于牛肉，真空包装后贮藏于冰温条件[（-1.5±0.5）℃]下考察其保鲜效果。结果表明：5种香辛料精油的最佳复合配方为1%丁香精油+1%大蒜精油+2%肉桂精油+0.375%生姜精油+0.75%八角精油。复合香辛料精油能够有效抑制牛肉中腐败微生物的生长繁殖和pH值的快速上升，减缓牛肉中脂肪氧化和蛋白质的分解速度，较好的维持牛肉的感官品质。牛肉通过香辛料复合精油处理并结合真空包装和冰温贮藏条件可以延长保鲜期到25 d。

牛肉；香辛料精油；配方优化；保鲜效果

我国是世界第三大牛肉生产国，同时也是牛肉消费大国，其销量仅次于猪肉[1-2]。牛肉蛋白质含量高、脂肪含量低、味道鲜美，深受消费者的喜爱，是一种优良的保健型肉食品[3]。但新鲜牛肉极易腐败变质，如何防止牛肉腐败、延长货架期是牛肉保鲜中亟待解决的问题。

真空包装采用阻隔性能好、氧气透过率低的包装材料，抽去袋内空气后进行贮藏、运输、销售[4]。由于袋内氧气含量低，抑制了好氧性微生物的生长繁殖，使肉中蛋白质分解和脂肪氧化的速度明显降低，减缓肉的组织结构及性质变化，从而使肉的新鲜品质保持较长时间[5-6]。冰温贮藏是指将食品置于0℃以下到其冻结点以上的温度范围内，是继冷冻和冷藏之后的第三代保鲜技术，它在维持食品最低的生理活性的基础上能较好的保持食品的食用品质，同时在抑制微生物繁殖、延长货架期方面也发挥着积极作用[7-8]。

随着人们安全意识的提高，保鲜剂向高效、方便、安全、天然的方向发展，因此包括香辛料精油、壳聚糖、海藻糖、果胶分解物等在内的天然保鲜剂的应用近年来得到人们的重视。香辛料精油中含有抗氧化性强的邻羟甲基苯甲酸内酯、酚类及其衍生物、黄酮类、聚乙炔、香豆素等活性成分，能够有效延缓食品中过氧化物的形成[9]。同时还对绝大多数的细菌、真菌、霉菌有较强的抑制效果[10]。如几种香辛料精油协同作用，则保鲜效果更强。蔡华珍等[11]研究了桂皮精油、八角精油、花椒精油、大蒜精油、生姜精油、丁香精油6种精油对冷藏调理鸡肉串的保鲜效果，并通过单因素试验和正交试验筛选出最佳复合香辛料精油保鲜剂。结果表明复合保鲜剂能使调理鸡肉串在4℃下保鲜达20 d。顾仁勇等[12]将丁香、肉桂、山苍子、牛至4种香辛料精油复合成不同浓度的保鲜液，对鲜猪肉进行处理后真空包装并在0℃～4℃中贮藏，发现9%丁香精油+9%牛至精油+9%肉桂精油+9%山苍子精油的复合保鲜剂可有效延长冷藏猪肉的保鲜期。

牛肉中营养成分丰富，在加工及包装过程中极易受到微生物的污染，如何较好地维持牛肉品质，课题组在前期做了两方面工作：1）将牛肉进行真空包装（vacuum packaging，VP）冰温（-1.5±0.5）℃贮藏，发现贮藏效果良好。2）分离鉴定出贮藏终点导致牛肉腐败的优势腐败菌。为了进一步延长牛肉货架期，提高其食用安全性，本试验拟利用香辛料精油保鲜牛肉，在优化出复合香辛料配方的基础上通过测定牛肉贮藏过程中的感官品质、微生物和理化指标变化，了解3种方式的协同增效作用对牛肉的保鲜效果，为综合保鲜技术的开发和应用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验菌株：[Carnobacterium divergens（M5）、Serratia proteamaculans（C1）、Brochothrix thermosphacta（S6）]：从真空包装冰温贮藏牛肉贮藏终点分离得到，保藏于山西农业大学食品学院畜产实验室。

新鲜的牛背最长肌（宰后24 h）：太谷双汇冷鲜肉专卖店；营养肉汤培养基、MRS肉汤培养基、营养琼脂培养基、MRS琼脂培养基：青岛海博生物技术有限公司；丁香精油、大蒜精油、肉桂精油、生姜精油、八角精油：青岛川百汇香料萃取有限公司；硼酸、三氯乙酸、氯仿、氧化镁、氢氧化钠、盐酸、丁基羟基茴香醚（BHA）、乙二胺四乙酸（EDTA）、2-硫代巴比妥酸、浓硫酸等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BCD-252KSF海尔冰箱：青岛海尔股份有限公司；LD5-2B低速离心机：北京雷勃尔医疗器械有限公司；ST2100pH计：奥豪斯仪器有限公司；WFJT200可见分光光度计：尤尼科仪器有限公司；HY-2调速多用振荡器：国华电器有限公司；DL-CJ-2F医用型洁净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；DHG-9243BS-Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；FA25高速剪切乳化分散机：上海弗鲁克流体机械制造有限公司；YXQ-LS-S2立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司；BSA-124S-CW电子天平：上海精密科学仪器有限公司。

1.3 试验设计

1.3.1 香辛料精油配方的优化

1.3.1.1 单因素试验

将丁香、大蒜、肉桂、生姜、八角5种精油用20%乙醇溶液分别配制成0.5%、1%、2%、3%的精油溶液，并以此作为因素和水平，以20%乙醇溶液为空白对照，利用牛津杯试验法，通过单因素试验测定5种精油对3种腐败菌Carnobacterium divergens（M5）、Serratia proteamaculans（C1）和 Brochothrix thermosphacta（S6）的最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）。

1.3.1.2 正交试验

在单因素试验基础上，选取丁香、大蒜、肉桂、生姜、八角五种香辛料精油各自的MIC值作为L16（45）正交试验的1水平，其1/2MIC、1/3MIC、1/4MIC分别为2、3、4水平，以对热死环丝菌的抑菌圈大小作为考查指标进行正交试验。

1.3.2 香辛料精油对牛肉保鲜效果的研究

将优化出的5种香辛料精油按最佳配方配制保鲜液，将新鲜牛肉在消过毒的案板上进行定量切割分块（200±20）g，并随机分成空白组和保鲜液组。空白组牛肉直接装入无菌真空袋进行真空包装；保鲜液组牛肉块在保鲜液中完全浸泡1 min后沥干，真空包装。将包装好的肉样于冰温室（-1.5±0.5）℃进行贮藏，在贮藏0、5、10、15、20、25、30、35 d取样进行微生物指标和理化指标的测定。

1.4 试验方法

1.4.1 牛津杯试验法

1）菌悬液制备：分别将Carnobacterium divergens（M5）菌株在MRS肉汤培养基中活化两次，Serratia proteamaculans（C1）、Brochothrix thermosphacta（S6）菌株在营养肉汤培养基中活化两次，使菌悬液浓度达到6 lg（CFU/mL）～7 lg（CFU/mL）备用。

2）平板的制备：将配置好的营养琼脂培养基和MRS培养基冷却至50℃～60℃，倾注于经干热灭菌的培养皿内，待平板凝固后备用。

3）涂平板：用灭菌移液枪头分别吸取0.2 mL的供试菌悬液于平皿内，用无菌涂布棒将菌悬液仔细涂布均匀。

4）将灭菌后的牛津杯轻轻压入平板1/3，每个平皿均匀放5个牛津杯（包括同一抑菌液的4个浓度梯度和空白对照）。每种抑菌液做3个平板重复。然后将平皿放入恒温培养箱，各菌按照最适培养温度和时间培养，用游标卡尺测量抑菌圈大小（直径mm）。

1.4.2 最低抑菌浓度（MIC值）

根据抑菌圈大小计算得到最低抑菌浓度。抑菌圈直径大于空白（即20%乙醇溶液）1 mm的香辛料精油抑菌液的最低浓度即为最低抑菌浓度。

1.4.3 菌落总数的测定

按GB 4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》规定的方法进行菌落总数的测定。

1.4.4 pH值的测定

按GB/T 9695.5-2008《肉与肉制品pH测定》规定的方法进行pH值的测定。

1.4.5 挥发性盐基氮的测定

参照GB/T 5009.44-2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》规定，采用半微量凯式定氮法进行挥发性盐基氮的测定。

1.4.6 TBARS值的测定

参考Liza[13]的方法测定硫代巴比妥酸值，用以评定脂肪氧化的程度。

1.4.7 感官评分标准

感官评定由10名专业人员组成的感官评定小组进行，针对牛肉的色泽、气味、组织状态、弹性进行评分。总分值为40分，低于26分视为产品不可食用。参考孙天利等[8]的方法，制定评分标准见表1。

1.5 数据处理

试验均重复3次，结果用平均值±标准偏差表示。数据统计分析采用Statistix 8.1软件包（St Paul，MN）中线性模型（Linear Model’s）程序进行方差分析，采用Tukey HSD程序进行差异显著性分析（P<0.05），采用SigmaPlot 10.0绘图软件作图。

表1 感官评分标准Table 1 Sensory scoring criteria

2 结果与分析

2.1 复合香辛料精油配方的优化

2.1.1 单因素试验确定5种香辛料精油的MIC值

不同浓度的香辛料精油对腐败菌的抑制作用如表2所示。

表2 5种香辛料精油对3种致腐菌的抑制作用Table 2 The antimicrobial effect of different spice oil on spoilage orgamisms

由表2可知，5种香辛料精油浓度为1%～3%时的抑菌圈均大于空白组，表现出较强的抑菌作用。空白（20%乙醇溶液）也具有抑菌作用，这是因为乙醇能使细菌中的蛋白质脱水变性从而导致其死亡。由表2确定出5种香辛料精油对3种腐败菌的最低抑菌浓度（MIC），如表3所示。

表3 5种香辛料精油对3种腐败菌的最低抑菌浓度（MIC）Table 3 The MIC of different spice oil on spoilage orgamisms %

由表2和表3综合分析可知，5种香辛料精油对变形斑沙雷菌（C1）的抑制效果明显优于热死环丝菌（S6）和分叉肉杆菌（M5），因此试验所确定的香辛料精油对热死环丝菌（S6）和分叉肉杆菌（M5）的MIC值对变形斑沙雷菌（C1）有足够的抑制性。

2.1.2 正交试验优化复合香辛料精油配方

经分析，5种香辛料精油对热死环丝菌（S6）和分叉肉杆菌（M5）抑制效果差异不显著（P＞0.05），所以选择较易培养的热死环丝菌（S6）作为受试菌进行正交试验。正交试验结果如表4所示。

表4 正交试验结果Table 4 Orthogonal array design matrix and experimental results

续表4 正交试验结果Continue table 4 Orthogonal array design matrix and experimental results

由表4可知，不同因素对热死环丝菌（S6）抑制作用的顺序依次是：丁香精油＞大蒜精油＞八角精油＞肉桂精油＞生姜精油，这结果与单独使用5种香辛料精油对热死环丝菌（S6）抑制效果略有不同。这说明肉桂、生姜和八角精油的抑菌效果在复配时受到了其他因素的影响，存在协同作用。刘晓丽[14]研究丁香、肉桂、黑胡椒精油对单核增生性李斯特菌的抑制作用时也发现，3种精油联合使用时相互之间存在协同作用。陈美霞等[15]也发现肉桂、百里香和生姜精油对荧光假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑制也存在协同增效作用。

从表4分析得出，理论上最优配比为1%丁香精油+2%大蒜精油+2%肉桂精油+1.5%生姜精油+0.75%八角精油，而试验得出的最优配比为第6组配方，即1%丁香精油+1%大蒜精油+2%肉桂精油+0.375%生姜精油+0.75%八角精油，理论配比与试验配比在生姜精油的比例上相差较大，通过进一步的验证试验得出两组的抑菌圈分别为为12.78 mm和12.69 mm，差异不显著（P＞0.05），本着经济的原则，确定5种香辛料精油的最佳配比为：1%丁香精油+1%大蒜精油+2%肉桂精油+0.375%生姜精油+0.75%八角精油。

2.2 复合香辛料精油对牛肉保鲜效果的研究

2.2.1 复合香辛料精油对牛肉菌落总数及感官品质的影响

贮藏过程中复合精油保鲜液对牛肉菌落总数和感官品质的影响如图1所示。

图1 贮藏过程中保鲜液对牛肉菌落总数和感官品质的影响Fig.1 Effect of spice oil on total visible counts and sensory quality of beef during storage

菌落总数是衡量牛肉腐败变质的重要指标。由图1-A可知，在贮藏0～5 d时菌落总数下降，可能原因是环境温度的变化及真空包装使好氧型微生物的生长繁殖受到抑制，导致一些不耐冷的好氧性微生物死亡。贮藏第5天后，空白组和保鲜液组肉样菌落总数差异显著（P＜0.05），空白组的菌落总数上升速度远远快于保鲜液组。到第15天时空白组肉样菌落总数为（5.93±0.06）lg CFU/g，接近国标上限值6.00 lgCFU/g。但添加保鲜液的肉样组到第25天时的菌落总数为（5.98±0.07）lg CFU/g，仍在安全范围之内，说明保鲜液能够有效的抑制微生物生长和繁殖，延长牛肉的保藏时间。

由图1-B可知，保鲜液组和空白组肉样在冰温贮藏过程中的感官评分均随贮藏时间的延长而降低。空白组样品的感官评分在第15天时分值是23.14，低于食用标准（26分），这时肉样酸败、色泽暗淡，已经腐败变质。保鲜液样品直到第30天才表现出轻微的腐败迹象。说明保鲜液能够延缓牛肉在色泽、弹性、气味等感官方面的劣变。综上说明，香辛料精油保鲜液在冰温贮藏过程中对牛肉的酸败起到抑制作用，相对于空白组的货架期10 d，能够延长牛肉的货架期到25 d。

2.2.2 复合香辛料精油对牛肉pH值和TVB-N值的影响

贮藏过程中复合精油保鲜液对牛肉pH值和TVB-N值的影响如图2所示。

图2 贮藏过程中保鲜液对牛肉pH值和TVB-N值的影响Fig.2 Effect of Spice oil on pH value and TVB-N value of beef during storage

pH值是检测牛肉新鲜与否的重要指标。由图2-A可知，在贮藏初期，两组牛肉pH值均呈现下降趋势，可能是以乳酸菌为代表的产酸微生物繁殖所致，且空白组牛肉pH值下降明显。第10天后肉样的pH值均呈现升高趋势，因为随着贮藏时间的延长，微生物分解蛋白质不断生成生物胺和一些碱性物质，肉样中的酸性物质被中和，碱性物质不断累积，因此pH值呈现缓慢升高。贮藏15 d以后，空白组的pH值上升趋势明显高于保鲜液组，第20天时达到6.01。香辛料复合保鲜液能够明显减缓pH值在贮藏期间的变化趋势，在贮藏0～25 d，趋势比较平缓，直到25 d以后pH值才开始显著上升。

挥发性盐基氮（TVB-N）是指在酶和微生物的作用下，蛋白质分解产生的氨（NH3）和胺类（RCH2NH2）等碱性含氮物质与在腐败过程中分解产生的有机酸结合而成的盐基态氮的总称，是评价肉类鲜度的常用指标之一。从图2-B可知，两组肉样TVB-N值差异表现在贮藏10 d之后。第20天时，空白组TVB-N值为16.57 Nmg/100 g，而保鲜液组仅为9.53 Nmg/100 g。顾仁勇等[16]也发现猪肉经复合香辛料精油处理后低温贮藏（0℃～4℃）18 dTVB-N值仍在二级鲜度范围内。

2.2.3 复合香辛料精油对牛肉硫代巴比妥酸反应物值（TBARS）的影响

复合香辛料精油对牛肉脂肪氧化的影响如图3所示。

图3 贮藏过程中保鲜液对牛肉TBARS值的影响Fig.3 Effec of spice oil on TBARS value of beef during storage

TBARS值的测定采用硫代巴比妥酸反应物法，其值是评价肉制品在贮藏期间脂肪氧化程度最常用的指标。由图3可知空白组和保鲜液组TBARS值在0～10 d差异不显著（P＞0.05）。但是在第10天后，空白组TBARS值增长速度明显高于保鲜液组。有研究表明，当TBARS值大于0.50 mg/kg时，肉样会产生酸败。空白组在第15天时TBARS值为（0.46±0.01）mg/kg，有轻微酸败味，保鲜液组TBARS值为（0.36±0.01）mg/kg，气味清新，由此表明保鲜液能够有效减缓牛肉的脂肪氧化速度。

3 结论

1）丁香精油、大蒜精油、肉桂精油、生姜精油、八角精油5种精油对热死环丝菌、分叉肉杆菌和变形斑沙雷菌均有较好的抑制作用，5种香辛料精油进行复配的最佳配比为：1%丁香精油+1%大蒜精油+2%肉桂精油+0.375%生姜精油+0.75%八角精油。

2）复合香辛料精油能够有效抑制牛肉中腐败微生物的生长繁殖，延缓pH值和TVB-N值的快速上升，抑制脂肪氧化，较好的维持牛肉的感官品质。香辛料精油复合保鲜液结合冰温贮藏和真空包装可以延长牛肉货架期至25 d。

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Formula Optimization of Complex Spice Essential Oil and Effect on the Quality of Beef under the Condition of Vacuum Packing and Ice-temperature Storage

ZHAO Yu-ming1，TIAN Jin-mei2，PENG Xiao-guang1
（1.Shanxi Institute of Biology，Taiyuan 030006，Shanxi，China；2.Shanxi Animal Husbandry and Veterinary School，Taiyuan 030024，Shanxi，China）

Five kinds of spice oil（clove，garlic，ginger，aniseed，cinnamon）were studied to observe bacteriostasis for Brochothrixthermosphacta，Carnobacteriumdivergens and Serratiaproteamaculans by cup plate method，and then five kinds of essential oils were used to optimize formula by orthogonal test.And the best formula was applied to fresh beef，after treatment by compound formula，fresh beef was vacuum packed and stored at ice temperature[（-1.5±0.5）℃].Through orthogonal experiment，the optimal compound formula of five kinds of spice essential oils was obtained：clove oil 1%，garlic oil 1%，cinnamon oil 2%，ginger oil 0.375%and aniseed oil 0.75%.Compound essential oils could effectively inhibit growth and reproduction of spoilage microorganism and rise rate of pH value in the beef，and slow down decomposition speed for lipid oxidation and protein in the beef，meanwhile maintain the sensory quality of beef.Combining compound spice essential oil treatment，vacuum packaging and ice-temperature storage could prolong the shelf life of beef to 25 days.

beef；spice oil；formula optimization；preservation

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.040

2017-02-09

山西省科技攻关项目“山西特色食品生产与安全控制技术体系技术研究-山西肉牛屠宰加工质量安全控制技术的研究”（20130313028-2）

赵玉明（1965—），男（汉），副研究员，本科，研究方向：生物技术与食品加工。