显色培养基上沙门氏菌及干扰菌的分离鉴定

王萍，董贵军，乔勇升，张占林

（江苏泰州市食品药品检验所，江苏泰州225300）

显色培养基上沙门氏菌及干扰菌的分离鉴定

王萍，董贵军，乔勇升，张占林

（江苏泰州市食品药品检验所，江苏泰州225300）

研究比较沙门氏菌显色培养基（CAS)上干扰菌与沙门氏菌的区别，提高沙门氏菌的分离鉴定效率。使用沙门氏菌和7株干扰菌（铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、施氏假单胞菌、荧光假单胞菌、斯氏普罗威登斯菌、摩氏摩根菌摩根亚种、粪产碱菌亚种）分别接种CAS、BS、XLD和HE培养基，观察菌落形态特征，分析生化试验结果，考察TTB和SC选择性增菌液对7株干扰菌的选择效果。7株干扰菌在CAS培养基上都是紫色菌落，仔细辨认大部分都可与沙门氏菌区分，无法从菌落形态区分的恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌通过在BS上的生长情况或生化试验可以排除，TTB和SC选择性增菌液对7株干扰菌的选择效果各不相同，提示检测过程中TTB和SC两种增菌液须同时使用，相互补充，提高检出率。

沙门氏菌；干扰菌；显色培养基；分离鉴定

沙门氏菌是引起食物中毒的重要病原菌，是食品安全与质量检测的一个重要指标，世界各国普遍规定食品中不得检出沙门氏菌[1]，在GB 29921-2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》标准中对沙门氏菌的检出要求更为严格。在权威的沙门氏菌检测国标中，将选择性增菌液接种鉴别培养基，分离可疑菌落这一环节非常重要，首先要挑选特异性强的分离培养基，减少干扰菌的影响，节约检测时间；其次还要挑选灵敏度好的分离培养基，以防出现假阴性造成漏检；最后需要检验人员丰富的经验去挑选可疑菌落，避免可疑菌落的后续生化鉴定试验中造成的人力物力的浪费。

近年来大量的文献[2-5]报道了沙门氏菌显色培养基（CAS）由于具有较高的敏感性和特异性，被实验室广泛应用于沙门氏菌的快速检测中。该培养基利用培养基中的细菌特异性酶的显色底物与沙门氏菌特有的辛酯酶反应，从而通过观察菌落颜色就可直接对菌落进行初步判定。但在实际检测过程中，往往还有一些干扰菌在此培养基上出现与沙门氏菌属相似的菌落，从而干扰检验人员的判断。文中将沙门氏菌与在CAS培养基上分离得到的7株干扰菌做了分析比较，从而为沙门氏菌的分离鉴定提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

铜绿假单胞菌 CGMCC1.10274、大肠埃希菌CGMCC1.4245和沙门氏菌CGMCC1.10603：中国普通微生物菌种保藏管理中心；恶臭假单胞菌、施氏假单胞菌、荧光假单胞菌、斯氏普罗威登斯菌、摩氏摩根菌摩根亚种、粪产碱菌亚种为江苏泰州市食品药品检验所实验室从样品中分离保存且经过梅里埃全自动细菌鉴定仪VITEK 2 Compact鉴定的菌株。

1.2 培养基及试剂

营养肉汤、四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）、亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）、亚硫酸铋琼脂（BS）、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（XLD）、HE琼脂（HE）、平板计数琼脂（PCA）和三糖铁琼脂（TSI）：北京陆桥技术有限责任公司；沙门氏菌显色培养基（CAS）：法国科玛嘉公司。

1.3 方法

1.3.1 培养基制备

试验所用培养基和试剂的制备均按照商品说明书制备。

1.3.2 菌株的复苏与接种

从9株菌株的保藏管中各挑取一环菌苔，分别划线接种于PCA平板上，36℃过夜培养复苏菌株。将复苏后的沙门氏菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、施氏假单胞菌、荧光假单胞菌、斯氏普罗威登斯菌、摩氏摩根菌摩根亚种、粪产碱菌亚种8株菌株分别划线接种于BS、XLD、HE、CAS平板，36℃培养18 h～24 h后观察各菌落形态（其中BS平板36℃培养40 h～48 h）。

1.3.3 选择性增菌液对沙门氏菌和干扰菌株的增菌效果测定

参照文献[6]，将PCA平板上复苏的菌株接种到营养肉汤中36℃培养过夜，制备10倍系列稀释的菌悬液，取10-5～10-7稀释液各1 mL倾注平板各两块，36℃培养18 h～24 h，作接种量计数，推算出10-5～10-7稀释液1 mL中所含的菌数。接种1 mL含菌量为1 000 CFU～5 000 CFU的稀释液于10 mL TTB和SC增菌液中，TTB增菌液置42℃培养箱中培养18 h～24 h，SC增菌液置36℃培养箱中培养18 h～24 h。取TTB、SC增菌液各10 μL于平板中，每个增菌液做两平行，用PCA琼脂倾注平板，36℃培养18 h～24 h，计算两个平行平板的平均数。

2 结果

2.1 沙门氏菌和干扰菌在不同培养基上的菌落形态沙门氏菌和7株干扰菌在各分离培养基上的生长和显色情况见表1。

表1 沙门氏菌和7株干扰菌在不同培养基上的菌落形态Table 1 The colony morphology of Salmonella strain and seven kinds of interfering bacteria in different media

在CAS显色平板上各菌株都呈类似的紫色菌落，但从菌落形态看，铜绿假单胞菌菌落较小，易与沙门氏菌菌落区分；施氏假单胞菌菌落有皱折；粪产碱菌亚种菌落不规则；而斯氏普罗威登斯菌和摩氏摩根菌摩根亚种在18 h观察时CAS显色平板上是乳白色和灰白色菌落，随着时间延长至38 h，菌落转为淡紫色菌落，由此说明控制好CAS显色平板的培养时间可以减少一些干扰菌的产生。恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌在CAS显色平板上的紫色菌落从形态和颜色上无法与沙门氏菌区别，需通过进一步的生化试验才能区分。

XLD、HE平板上斯氏普罗威登斯菌为灰白色菌落，其他6株干扰菌为粉红色菌落；BS平板上铜绿假单胞菌为绿色菌落、斯氏普罗威登斯菌为灰绿色菌落、摩氏摩根菌摩根亚种为浅绿色菌落，而其他4株干扰菌都被抑制没有生长。

2.2 沙门氏菌和干扰菌的生化试验情况

挑取PCA平板上培养18 h～24 h的新鲜培养物做生化试验，结果见表2。

根据TSI琼脂和氧化酶试验，铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、施氏假单胞菌、荧光假单胞菌、粪产碱菌亚种5株菌可直接判定为非沙门氏菌，斯氏普罗威登斯菌、摩氏摩根菌摩根亚种虽然赖氨酸脱羧酶为阴性，但还需要结合靛基质、pH7.2尿素、氰化钾生化试验才能排除是甲型副伤寒沙门氏菌。

表2 沙门氏菌和7株干扰菌的生化试验结果Table 2 Biochemical test results of Salmonella strain and seven kinds of interfering bacteria

2.3 TTB和SC选择性增菌液对干扰菌的选择性情况以沙门氏菌和大肠埃希氏杆菌为对照，检测了

TTB和SC两种选择性增菌液对7种干扰菌株的增菌效果，见表3。

表3 TTB和SC增菌液对7株干扰菌的选择性效果Table 3 The selective effect of TTB and SC Broth on seven kinds of interfering bacteria

从表3可以看出，TTB和SC对目标菌沙门氏菌的增菌效果好，对非目标菌大肠埃希氏杆菌部分抑制；7株干扰菌中，两种增菌液对铜绿假单胞菌和斯氏普罗威登斯菌都有增菌作用，对荧光假单胞菌和粪产碱菌亚种两株菌几乎是完全抑制，对于恶臭假单胞菌、施氏假单胞菌这两种菌SC增菌液的选择性强于TTB增菌液，对于摩氏摩根菌摩根亚种则是TTB选择性强于SC。

3 结论与讨论

沙门氏菌一般生化特性是利用葡萄糖产酸产气，产H2S，不发酵乳糖和蔗糖；氧化酶阴性；赖氨酸脱羧酶阳性。一些培养基（如XLD、HE、BS）就是根据这些原理设计而成，但这些一般特征并不是沙门氏菌的独有特征，同时还有一些个别的沙门氏菌没有这些特征，如，奇异变形杆菌及柠檬酸杆菌等一些干扰菌在XLD和HE培养基上的菌落形态和沙门氏菌相似，猪霍乱沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏菌由于不产或延迟产H2S在XLD和HE培养基上又会漏检，此外伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌及一部分鸡白痢沙门氏菌不产气，亚利桑那沙门氏菌和双相亚利桑那沙门氏菌一部分菌株可以发酵乳糖，甲型副伤寒沙门氏菌的赖氨酸脱羧酶为阴性，BS平板上一些肠杆菌与沙门氏菌的形态特征很相似，难以分辨，检验者既不能把貌似沙门氏菌的细菌当做沙门氏菌，也不能把沙门氏菌当做非沙门氏菌，因此在分离检测沙门氏菌时培养基的选择以及可疑菌落的挑选很重要。

XLD、HE平板上除了斯氏普罗威登斯菌以外，其他6株干扰菌都与不产H2S的沙门氏菌菌落形态相似；CAS平板上7株干扰菌都是紫色菌落，除了恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌外，其余菌株通过仔细辨认都可与沙门氏菌区分，CAS培养时间控制在24 h以内可以减少一些干扰菌的出现；BS平板上大部分菌都被抑制不生长，包括CAS平板上无法从菌落形态区分的恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌，而其他生长的干扰菌也是非典型菌落，由此可见BS平板与CAS平板搭配使用是筛选分离沙门氏菌的最好选择。

无法从菌落形态排除为非沙门氏菌的可疑菌落应结合生化反应做判断，TSI琼脂和氧化酶试验可以快速排除部分干扰菌菌株，对于一些易在CAS平板上造成混淆的假单胞菌来说，氧化酶试验更是方便快捷。赖氨酸脱羧酶、靛基质、pH7.2尿素、氰化钾是进一步鉴定沙门氏菌的重要生化反应，由于微量生化系统和全自动分析仪都只有赖氨酸脱羧酶一项，因此需要实验人员额外补做试验。

食品样品基质多样复杂，增菌后除了少量的目标污染菌，还会有大量的杂菌产生，因此要提高食品中沙门氏菌的检出率，非选择性前增菌时要控制好8 h～18 h时间[7]，尽可能地减少其他干扰菌的生长。选择性增菌液TTB和SC的选择性强弱对7株干扰菌各不相同，有的完全抑制，有的部分抑制，有的反而促进了干扰菌的生长，因此在检测过程中TTB和SC两种增菌液须同时使用，才可以相互补充，提高检出率。

[1]黄宝莹,佘之蕴,林耀文.四种方法检测食品中沙门氏菌的比较[J].食品工业科技,2014,35(15)：185-192

[2]Pere JM,Cavalli P,Roure C,et a1.Comparison of four chromogenic media and hektoen agar for detection and presumptive identification of Salmonella strains in human Stools[J].J Clin Microbiol,2003,41：1130-1134

[3]刘振,于奂,肖强,等.一种有效检测沙门氏菌的显色培养基的研究[J].中国食品卫生杂志,2007,19(6)：520-523

[4]卢勉飞,蔡芷荷,吴清平,等.显色培养基快速检测沙门氏菌效果的研究[J].中国卫生检验杂志,2008,18(12)：2618-2620

[5]王志伟.不同沙门氏菌及干扰菌的分离鉴定[J].食品研究与开发, 2012,33(1)：168-170

[6]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB4789.28-2013食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求[S].北京：中国标准出版社,2013：13-14

[7]中华人民共和国卫生部.GB4789.4-2010食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验[S].北京：中国标准出版社,2010：4

Isolation and Identification of Salmonella and Interference Strains in Chromogenic Medium

WANG Ping， DONG Gui-jun，QIAO Yong-sheng，ZHANG Zhan-lin
（Jiangsu Taizhou Institute for Food and Drug Control，Taizhou 225300，Jiangsu，China）

To compare the differences between interference strains and Salmonella in Chromogenic agar Salmonella（CAS）and improve efficiency of isolating and identifying Salmonella.Salmonella and seven kinds ofinterfering bacteria（Pseudomonas aeruginosa，Pseudomonas putida，Pseudomonas stutzeri，Pseudomonas fluorescens，Providencia stuartii，Morganella morganii ssp morganii，Alcaligenes faecalis ssp faecalis）were inoculated in isolation medium（CAS，BS，XLD and HE）to observe the characteristics of the colony form，analyzed biochemical test results，investigated the selective effect of TTB and SC Broth on seven kinds of interfering bacteria.Seven kinds of interfering bacteria in CAS medium were purple colonies，most of them can be differentiated from Salmonella by recognizing carefully.Pseudomonas putida，Pseudomonas fluorescens could be excluded by BS medium or biochemical tests，the selective effect of TTB and SC Broth on seven kinds of interfering bacteria was different，suggested that TTB and SC Broth must be used together，then they will complement each other nicely to improve efficiency in detection.

Salmonella；interference strain；chromogenic medium；isolation and identification

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.034

2016-07-17

王萍（1983—），女（汉），工程师，硕士，研究方向：食品微生物检测。