新疆两色金鸡菊中原花青素含量测定体系考察

刘谢英，冯玉洁，冶晓童，姚新成，2，*

（1.石河子大学药学院，新疆石河子832000；2.石河子大学新疆特种植物药资源教育部重点实验室，新疆石河子832000）

新疆两色金鸡菊中原花青素含量测定体系考察

刘谢英1，冯玉洁1，冶晓童1，姚新成1，2，*

（1.石河子大学药学院，新疆石河子832000；2.石河子大学新疆特种植物药资源教育部重点实验室，新疆石河子832000）

为准确测定新疆两色金鸡中原花青素含量，选择合适的对照品和测定体系。通过比较香草醛-盐酸、正丁醇-盐酸、铁盐（Fe3+）催化法、pH示差法等多种测定体系下，两色金鸡菊提取物和对照品儿茶素或原花青素的连续波长扫描图谱，考察光谱吸收曲线的一致性和λmax峰位值，进而选择适合测定两色金鸡菊中原花青素含量的显色反应体系。结果表明，两色金鸡菊提取物与原花青素对照品在正丁醇-盐酸、Fe3+催化法和pH示差法产生的光谱吸收曲线相似，λmax峰位值更接近。因此，可以用这3种体系快速测定两色金鸡菊中原花青素的含量。结果显示，在特定的测定体系中，选择合适的对照品能准确测定新疆两色金鸡菊中原花青素的含量。

两色金鸡菊；原花青素；显色反应体系

两色金鸡菊（Coreopsis tinctoria Nutt.）为菊科金鸡菊属、蛇目菊种一年生草本植物蛇目菊的全草。原产于美洲内陆干旱地区，主要作为景观植物栽培，后分布于世界各地。在我国，两色金鸡菊野生资源较为丰富。主要分布于新疆海拔1 500 m～3 000 m的昆仑山区，故又称“昆仑雪菊”、“雪菊”、“昆仑血菊”。当地居民常采集新鲜头状花序浸泡当花茶饮用，可治疗燥热烦渴、高血压、心慌、胃肠不适、食欲不振等病症。新疆维吾尔医院也将其作为一种维吾尔药材使用，具有清热解毒、活血化瘀和胃健脾之功效[1]。目前，新疆两色金鸡菊被人们广泛用作茶饮品在使用。研究表明，两色金鸡菊富含黄酮类、酚类、多糖、皂苷类、氨基酸、挥发油、多种微量矿物质元素等化学成分，具有较高的食用价值[2-3]。

有文献报道，新疆两色金鸡菊头状花序（Coreopsis tinctoria flowering tops，CTFT）中含大量的花色苷类和原花青素成分[4]。而该类物质具有类黄酮C6-C3-C6骨架结构，因此在测定过程中易受到黄酮类物质成分干扰而使测定结果不准确。目前，对原花青素的含量测定多采用比色法和HPLC法。HPLC法具有快速准确等优点，但由于无法获得样品中所有待测组份的对照品，只能测定其中的个别成分进行定量，测定结果并不能代表整体原花青素的含量[5]。而比色法具有简单、快速等优点。在选择合适对照品做参照和适当的反应体系下，比色法可以准确测定某一类物质的含量。因此，选取合适的标准对照物质，建立适当的测定反应体系，准确测定新疆两色金鸡菊中原花青素的含量，对控制该天然植物质量，开发相关功能性食品和综合利用该植物资源是很有意义的。

1 材料与方法

1.1 材料

两色金鸡菊购于新疆和田地区策勒县努尔乡昆仑山区高海拔种植区（2013年11月），经石河子大学药学院李鹏副教授鉴定为菊科金鸡菊属一年生草本植物蛇目菊的干燥头状花序。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

UV-2041PC紫外分光光度仪：日本岛津；BP211D十万分之一电子分析天平：北京Sartorius；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵：巩义市英峪予华仪器厂；TP300超声波提取器：北京天鹏电子新技术有限公司；旋转蒸发仪RE-2000：上海亚荣生化仪器厂；Quorum K750X冷冻干燥仪：英国；5-1000 μL手动移液器：苏州百得仪器有限公司；恒温水浴锅：北京光明医疗器械厂。

1.2.2 试剂

甲醇、正丁醇、浓盐酸、香草醛、硫酸铁铵等均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；水为去离子纯净水。

1.2.3 试药

原花青素，化学对照品（含量＞98%）：广州超粤生物科技有限公司；儿茶素，化学对照品（含量＞99%）：中国药品生物制品检定所。

1.3 方法

1.3.1 两色金鸡菊中原花青素的提取

两色金鸡菊研碎，过20目筛。采用响应面法优化超声波提取条件：液料比21∶1（mL/g），乙醇浓度为60%（含1%乙酸），提取30 min（250 W，40 kHZ）。提取物经减压浓缩、冷冻干燥即得。

1.3.2 原花青素的含量测定体系考察

1.3.2.1 样品溶液、儿茶素和原花青素对照溶液UVVis吸收谱图

分别移取儿茶素甲醇标准溶液（1.0 mg/mL）、原花青素甲醇标准溶液（0.2 mg/mL）和CTFT提取物甲醇液（2.0 mg/mL）各1.0 mL至10.0 mL试管中，加入9.0 mL甲醇，摇匀。以甲醇为空白对照，在波长200 nm～600nm范围内进行全波段扫描。

1.3.2.2 香草醛-盐酸显色反应体系[6]

国内多数文献报道测定原花青素含量采用此法。该法的原理是原花青素在盐酸/硫酸反应体系中，C6-C3-C6中A环有较高的化学活性，其结构中的间苯三酚或间苯二酚与香草醛发生缩合，产物在浓酸作用下就会形成有色的正碳离子。原花青素是一大类双黄酮衍生物的多酚化合物的总称，是由多羟基黄烷-3-醇单元构成的低聚体或多聚体，由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成。香草醛-盐酸主要与原花青素单体和低聚体反应，故初步判断可以用原花青素或儿茶素作为对照品，测定样品中的原花青素含量。具体测定过程如下：

1）以儿茶素为对照品香草醛-盐酸显色反应体系

分别移取儿茶素甲醇标准品溶液（1.0 mg/mL）和CTFT提取物甲醇液（0.4 mg/mL）各1.0 mL至10.0 mL试管中，加入6.0 mL香草醛甲醇溶液（4%）和3.0 mL浓盐酸，摇匀。水浴30℃条件下避光反应30 min。反应产物以甲醇稀释至合适浓度（吸光度A=0.2～0.8），以甲醇为空白，在波长400 nm～700 nm范围内进行全波段扫描。

2）以原花青素为对照品香草醛-盐酸显色反应体系

分别移取原花青素标准品溶液（0.2 mg/mL）和CTFT提取物甲醇液（0.4 mg/mL）各1.0 mL至10.0 mL试管中，加入1.25 mL香草醛甲醇溶液（1%）和1.75 mL盐酸溶液（8%），摇匀。水浴30℃避光反应20 min。反应产物以甲醇稀释至合适浓度（吸光度A=0.2～0.8），以甲醇为空白，在波长400 nm～700 nm范围内进行全波段扫描。

1.3.2.3 正丁醇-盐酸显色反应体系[7]

该法的原理是原花青素聚合体在正丁醇-盐酸反应体系中，经高温加热产生有色物质，而生成有色物质的量与原花青素的量成正比。在正丁醇-盐酸反应体系中，儿茶素或表儿茶素等单体不易发生反应，故在该反应体系中常选择原花青素作对照品进行含量测定。

测定过程：分别移取原花青素甲醇对照品溶液（0.5 mg/mL）和CTFT提取物甲醇溶液（4 mg/mL）各1.0 mL至10.0 mL具塞试管中，再加入6.0 mL正丁醇-盐酸溶液（95∶5），摇匀。沸水浴40 min后迅速冷却至室温。反应产物以正丁醇-盐酸溶液（95∶5）稀释至合适浓度（吸光度A=0.2～0.8），以正丁醇-盐酸溶液为空白，在400 nm～700 nm范围内进行全波段扫描。

1.3.2.4 铁盐（Fe3+）催化比色法[8]

该法原理与盐酸-正丁醇法相似，即以正丁醇和盐酸为反应介质，原花青素在酸性条件下加热转化成为红色的花青素。与正丁醇-盐酸反应体系不同之处是加入Fe3+离子为催化剂，使生成物显色反应更灵敏。

测定过程：分别移取原花青素甲醇对照品溶液（0.5 mg/mL）和CTFT提取物甲醇溶液（2.0 mg/mL）各1.0 mL至10.0 mL具塞试管中，加入0.20 mL硫酸铁铵盐酸溶液（2.0 mol/L），混匀。再加入6.0 mL正丁醇-盐酸溶液（95∶5），摇匀。沸水浴40 min后迅速冷却至室温。反应产物以正丁醇-盐酸溶液（95∶5，体积比）稀释至合适浓度（吸光度A=0.2～0.8），以正丁醇-盐酸溶液为空白，在波长400 nm～700 nm范围内进行全波段扫描。

1.3.2.5 pH示差分光光度法[9-10]

该法的原理是原花青素或花青素在不同的pH值条件下，存在蓝色的醌式（脱水）结构、红色的正离子结构、无色的甲醇假碱和类查尔酮等4种结构。在低pH值时，溶液呈现最强的红色，随着pH值的增大，溶液逐渐褪至无色。可根据不同pH值条件下光谱的变化测定原花青素色素含量。

测定过程：移取1.0 mL CTFT提取物甲醇溶液（0.4 mg/mL）3份至10.0 mL具塞试管中。其中2份分别加入9.0 mL（pH=6、3）的缓冲溶液，30℃避光水浴80 min。以相应的缓冲溶液为空白，在波长200 nm～500 nm范围内进行全波段扫描。

2 结果与分析

2.1 CTFT提取物与儿茶素和原花青素标准对照溶液连续波长扫描图

按1.3.2.1项下内容进行操作，获得儿茶素、原花青素和CTFT提取物连续波长扫描图。结果见图1。

由图1可知，样品提取液、儿茶素和原花青素标准对照液在紫外区200 nm～300 nm范围内吸收图谱相似，最大吸收波长均在（280±1）nm，说明样品中含有花青素类物质；但样品提取液本底吸收较高，显示有明显的干扰成分。同时，可见区有明显的吸收峰，说明样品中有大量的有色物质如花色苷等。因此，不能采用儿茶素或原花青素为对照品UV法直接测定两色金鸡菊中原花青素含量。

图1 两色金鸡菊提取物与儿茶素和原花青素标准对照溶液连续波长扫描图Fig.1 The spectrogram of CTFT extract，catechin and proanthocyanidin standards at 200 nm～600 nm

2.2 香草醛-盐酸显色反应体系

按1.3.2.2项下内容进行操作，获得儿茶素、原花青素和CTFT提取物连续波长扫描图。结果见图2。

图2 两色金鸡菊提取物与儿茶素和原花青素标准对照在香草醛-盐酸显色反应体系连续波长扫描图Fig.2 The spectrogram of CTFT extract，catechin and proanthocyanidin standards in vanillin-hydrochloric acid reaction system

由图2可知，在香草醛-盐酸显色反应体系中，儿茶素和原花青素标准对照液在360 nm～600 nm范围内吸收图谱相似，最大吸收波长均在（500±2）nm；但CTFT提取液吸收图谱与之差异较大，最大吸收波长（522±2）nm。因此，该反应体系也不适合测定两色金鸡菊中原花青素含量。

2.3 正丁醇-盐酸显色反应体系

按1.3.2.3项下内容进行操作，获得原花青素和CTFT样品连续波长扫描图。结果见图3。

由图3可知，在正丁醇-盐酸显色反应体系中，样品和原花青素标准对照液在400 nm～700 nm范围内吸收图谱相似，最大吸收波长均在（538±2）nm，而且样品本底吸收很低，干扰较少。因此，该反应体系可用于测定两色金鸡菊中原花青素的含量。

图3 两色金鸡菊提取物与原花青素对照品在正丁醇-盐酸显色反应体系连续波长扫描图Fig.3 The spectrogram of CTFT extract and proanthocyanidin standard in n-butanol-hydrochloric acid reaction system

2.4 铁盐（Fe3+）催化比色法

按1.3.2.4项下内容进行操作，获得原花青素和样品连续波长扫描图。结果见图4。

图4 两色金鸡菊提取物与原花青素对照品在Fe3+催化比色法反应体系连续波长扫描图Fig.4 The spectrogram of CTFT extract and proanthocyanidin standard in Fe3+chromogenic method reaction system

由图4可知，在Fe3+催化显色反应体系中，样品和原花青素标准对照液在400 nm～700 nm范围内吸收图谱相似，最大吸收波长均在（546±2）nm，而且样品本底干扰很小。因此，该反应体系可用于测定两色金鸡菊中原花青素的含量。

2.5 pH示差分光光度法

按1.3.2.5下内容进行操作，获得样品在不同pH值条件下连续波长扫描图。结果如图5。

由图5可知，在pH=3和6的条件下，相同浓度的两色金鸡菊提取物溶液吸收图谱相似，最大吸收峰位也一致，但最大吸收度发生了改变。根据其改变的ΔA值，可以计算出样品中原花青素的含量。因此，该法也适合用于样品中原花青素的含量测定。

图5 两色金鸡菊提取物在不同pH值条件下连续波长扫描图Fig.5 The spectrogram of CTFT extract in different pH values

3 讨论

1）原花青素是存在于植物中的一大类双黄酮衍生物的天然多酚化合物的总称，是由多羟基黄烷-3-醇单元构成的低聚体或多聚体，由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成。在香草醛-盐酸反应体系下，原花青素单体和低聚体可与香草醛发生呈色反应，故可选原花青素或儿茶素作为对照品进行含量测定；在正丁醇-盐酸反应体系下，儿茶素或表儿茶素等单体不易发生呈色反应，只有多聚体或单聚体才产生，故在该反应体系中常选择原花青素作对照品进行含量测定；而铁盐催化体系与正丁醇-盐酸反应体系相同，儿茶素或表儿茶素等单体不易发生呈色反应，故只能选原花青素作为对照品进行含量测定。

2）香草醛-盐酸显色反应体系中，可测定原花青素单体及低聚体的总含量。但试验中发现该法测定原花青素含量时误差较大，反应体系透明度较差，测定结果不稳定，推测原因可能与原花青素在该条件下易氧化分解有关。

3）铁盐催化比色法是在盐酸-正丁醇法的基础上增加了Fe3+做催化剂，增强了反应的灵敏度，同时增加了显色反应的稳定性。

4）pH差示分光光度法主要是根据不同pH值条件下，原花青素光谱的变化来测定原花青素的含量。但在该反应条件下，对试验条件要求苛刻（温度、pH值，反应时间等），微小的pH值变化都会引起吸光度值的改变。因此，在该反应体系下测定样品中原花青素的含量需做随行对照，并保持反应条件一致性。

4 结论

本研究通过比较分析香草醛-盐酸、正丁醇-盐酸、铁盐（Fe3+）催化法、pH示差法等多种测定体系下，两色金鸡菊提取物和对照品儿茶素或原花青素的连续波长扫描图谱一致性和λmax峰位值。结果显示，在香草醛-盐酸显色反应体系下，以儿茶素或原花青素为对照品均不适合测定新疆两色金鸡菊中原花青素的含量；而正丁醇-盐酸显色体系、铁盐（Fe3+）催化比色法和pH示差法均可以原花青素为对照品测定两色金鸡菊中原花青素的含量；其中Fe3+催化比色法反应更灵敏和更稳定。所以，新疆两色金鸡菊中原花青素含量测定可用原花青素为对照，使用Fe3+比色法和pH示差法进行。

本含量测定体系方法简便易操作，且成本低，易于在实验室进行快速分析样品中的原花青素含量。

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The Determination of Proanthocyanidins Content in Coreopsis tinctoria Nutt.from Xinjiang in Different Chromogenic Reaction System

LIU Xie-ying1，FENG Yu-jie1，YE Xiao-tong1，YAO Xin-cheng1，2，*
（1.School of Pharmacy，Shihezi University，Shihezi 832000，Xinjiang，China；2.Ministry of Education Key Laboratory of Xinjiang Endemic Phytomedicine Resources，Shihezi University，Shihezi 832000，Xinjiang，China）

To select the appropriate standards and chromogenic reaction system for determination the content of proanthocyanidins in Coreopsis tinctoria flowering tops（CTFT）from Xinjiang，the spectrum of CTFT extract，catechin and proanthocyanidins standards were compared in vanillin-hydrochloric acid，n-butanol-hydrochloric acid，Fe3+catalytic chromogenic method and pH differential spectrophotometry reaction system.The spectral absorption curve and the wavelength λmaxpeak values were investigated for selecting a suitable reaction system to determine the content of proanthocyanidins of CTFT.The spectrum of CTFT extract and proanthocyanidins standard were similar in n-butanol-hydrochloric acid，Fe3+chromogenic method and pH differential spectrophotometry reaction system，and the λmaxvalues were also closer to standard.Therefore，the content of proanthocyanidins in CTFT could be assayed by these three chromogenic reaction system.The content of proanthocyanidins in CTFT could be accurately determined in a particular reaction system and using an appropriate standard.

Coreopsis tinctoria Nutt.；proanthocyanidins content；chromogenic reaction system

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.026

2016-09-30

国家自然基金项目（81660641）；新疆生产兵团重点领域科技攻关项目（2014BA031）；石河子大学高层次人才科研启动项目（RCZX201328）

刘谢英（1993—），女（汉），硕士研究生，药物分析专业。

*通信作者：姚新成（1973—），男（汉），副教授，博士，从事中药与天然产物活性研究。