低氧条件下缺氧诱导因子-1对胎鼠心肌细胞内钙离子转运的影响

张 力，邓春玉，邝素娟，章晓华，庄 建，周成斌

·基础研究·

低氧条件下缺氧诱导因子-1对胎鼠心肌细胞内钙离子转运的影响

张 力，邓春玉，邝素娟，章晓华，庄 建，周成斌

目的 观察低氧条件下缺氧诱导因子-1(HIF-1)对胎鼠心肌细胞内钙离子(Ca2+)转运的影响，探索胎儿心肌保护新方法。方法 取胎龄14～18 d Sprague-Dawley(SD)大鼠胎鼠的心肌细胞置于含5% CO2，3% O2和92% N2的三气培养箱在37℃下培养24 h，分3组进行干预：对照组；HIF-1激动剂(DMOG)100 μM(DMOG组)；HIF-1抑制剂(Acriflavine)10 μM(Acriflavine组)。共同作用24 h后，分别进行实时荧光定量PCR(real time-PCR, RT-PCR)和免疫印迹分析(Western-blot)检测胎鼠心肌细胞HIF-1α、L型Ca2+通道(LCa)、T型Ca2+通道(TCa)、钠钙交换蛋白(NCX)、Ryanodine受体和肌质网Ca2+-ATP酶(SERCA2a) mRNA表达及蛋白水平。在激光共聚焦显微镜下观察心肌细胞内Ca2+浓度的变化。结果 RT-PCR结果显示HIF-1α的mRNA表达量DMOG组较对照组显著升高，Acriflavine组较对照组和DMOG组显著降低，TCa的mRNA表达量DMOG组较Acriflavine组显著升高、NCX的mRNA表达量DMOG组较对照组显著升高，Acriflavine组较对照组和DMOG组显著降低，Rynaodine受体的mRNA表达量Acriflavine组较对照组显著降低，DMOG组较Acriflavine组显著升高，SERCA2α的mRNA表达量Acriflavine组较对照组和DMOG组显著升高(P<0.05，n=5)；Western-blot结果显示HIF-1α的蛋白表达量DMOG组较对照组及Acriflavine组均显著升高，LCa的蛋白表达量DMOG组较对照组及Acriflavine组显著升高(P<0.05，n=5)。激光共聚焦显微镜下测定钙荧光量，DMOG组较对照组及Acriflavine组显著增加(P<0.001，n=12)。结论 在低氧条件下，DMOG过度激活HIF-1，使胎鼠心肌细胞内Ca2+超载明显，Acriflavine抑制HIF-1活性，减轻胎鼠心肌细胞Ca2+超载，增强心肌细胞调节Ca2+的能力，对未成熟心肌起保护作用。

低氧；缺氧诱导因子-1；SD胎鼠；心肌细胞；钙离子转运

低氧是胎儿心脏发育过程中不可或缺的生长条件，研究显示低氧激活缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)，参与早期胎儿心脏的形成、冠脉血管的生长、流出道的成形和中后期的胎儿心脏发育等[1]。胎儿心肌细胞内钙离子(Ca2+)转运与心功能的改变密切相关。为了了解低氧条件下HIF-1对未成熟心肌细胞内Ca2+转运的影响，本研究通过对胎鼠心肌细胞在低氧条件下进行培养，并采用药物对HIF-1的活性进行干预，检测其对心肌细胞内Ca2+转运的影响，旨在探讨HIF-1在胎儿心肌保护中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验药物 麻醉药物为地西泮注射液(10 mg/2 ml，上海旭东海普药业有限公司)，氯胺酮注射液(100 mg/2 ml，福建古田药业有限公司)；三抗、DMEM/F-12(1∶1)、PBS、胎牛血清(gibco公司，美国)；二甲基乙二酰氨基乙酸(DMOG，Selleck)，盐酸吖啶磺(Acriflavine，aladdin)；氯仿、异丙醇、无水乙醇(广州中南化工)；DEPC、Trizol、Premix EX TaqTM(Probe qPCR)、Prime ScriptTMRT reagent Kit、Oligod(T) Primer、Random Primer(TaKaRa)；一抗试剂：NCX1、HIF-1-α-ChIP Grade、TPCN1、SERCA2 ATPase、GAPDH(内参)(Abcam)；二抗试剂：Goat anti-rabbit IgG-HRP(SANTA CRUZ)；PageRuler Prestained Protein Ladder(SM0671)(Fermentas)；BeyoECL Plus(超敏ECL化学发光试剂盒)(P0018)(碧云天公司)；SDS、TEMED(Sigma)；丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸(Amresco)；甲叉双丙烯酰胺(Fluka)；Tris(Roche)；1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8、1.0 mol/L Tris-HCl pH 6.8、TBST缓冲液、还原型SDS-PAGE 5×Loading Buffer(广州蓝吉生物技术有限公司)；5×7胶片(柯达)；PVDF膜(Millipore)；脱脂奶粉(Biotoped)；显影粉、定影粉(天津世纪奥博有限公司)；甲醇(天津诺克有限公司)。

1.2 实验动物 Sprague-Dawley(SD)孕鼠，孕14～18 d，体质量约400 g，购于广州中医药大学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2013-0034。

1.3 实验仪器 Stemi DV4型体式显微镜(ZEISS公司，德国)；Spectrafuge 6C型高速离心机(Labnet公司，美国)；二氧化碳培养箱(多气体型，SANYO，日本)；荧光实时定量仪7300(ABI公司，美国)；C1000 Thermal cycler PCR仪、Mini型蛋白电泳系统(BIO-RAD公司，美国)；制冰机(Scotsman公司，美国)；Scanspeed 1730R低温离心机(Labogene，丹麦)；QL-901微型振荡器、旋涡振荡器(海门市麒麟医用仪器厂)；脱色摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；LG2000数码凝胶图像分析系统(杭州朗基科学仪器有限公司)；X射线摄影暗匣AX-Ⅱ(127 mm×178 mm)(广东粤华医疗器械厂有限公司)；JJ100电子天平(常熟市双杰测试仪器厂)；TGL-18R冷冻高速离心机(珠海黑马医学仪器有限公司)；DK-8D电热恒温槽(上海-恒科技有限公司)；岛津UV-1750紫外分光光度仪(日本)。

1.4 胎鼠心肌细胞原代培养 SD孕鼠，给予地西泮5 mg，氯胺酮50 mg肌注麻醉，按照常规无菌操作原则进行开腹，剖开子宫取出胎鼠。剪开胎鼠胸部取其心脏，放入含DMEM/F-12培养基的培养皿，去除外周血管、脂肪和结缔组织，用DMEM/F-12洗3遍，用眼科剪剪成1 mm3的块状组织，置于含1%胰酶液的离心管中，轻轻吹打后进行低速离心，弃上清。再加入1%胰酶液5 ml，反复吹打1 min，收集吹打消化后的液体，放入含10%胎牛血清5 ml的离心管中终止消化。依次反复，直至组织块完全溶解。将收集的液体用筛网过滤，1 000 rpm室温离心10 min。弃上清，加入4 ml含DMEM/F-12 45 ml+10%胎牛血清5 ml+三抗0.5 ml的不完全培养基，吹打成单细胞悬液，接种于培养皿内，于含5%CO2，3%O2和92%N2的三气低氧培养箱内37℃差速贴壁2 h，分离非心肌细胞，所得未贴壁细胞即心肌细胞。

1.5 分组加药处理 实验采取随机对照分组，分为三组：①对照组；②DMOG 100 μM(DMOG组)；③Acriflavine 10 μM(Acriflavine组)。加药后置于含5% CO2，3% O2和92% N2的三气低氧培养箱中与药物共同作用24 h。

1.6 荧光实时定量PCR(RT-PCR) 测定HIF-1α、L型Ca2+通道(LCa)、T型Ca2+通道(TCa)、钠钙交换蛋白(NCX)、Ryanodine受体和肌质网Ca2+-ATP酶(SERCA2a) mRNA表达。参照文献[2-3]方法，用Trizol法提取总RNA，根据逆转录试剂盒提供方法进行逆转录，所得cDNA进行荧光实时定量PCR，反应体系见表1，引物设计及反应条件见表2，根据PCR反应的溶解曲线及曲线特征，评价引物增殖反应的特异性记录各样本反应的阈值(Threshold cycle，Ct)，样本mRNA表达量计算：第一步：⊿Ct=Ct目的基因-Ct内参基因；第二步：⊿⊿Ct=⊿Ct-⊿Ct对照组/最大值；第三步：样本的相对表达量=2-⊿⊿Ct。

表1 RT-PCR反应体系

1.7 蛋白免疫印迹 检测胎鼠心肌细胞HIF-1α、LCa、NCX 和SERCA2a的蛋白表达。将上述分组培养的细胞去除培养液，加入细胞裂解液，离心后取上清进行蛋白定量。随后进行SDS-PAGE电泳，样品经过分离胶及浓缩胶，待溴酚蓝至分离胶下缘时停止电泳，随后进行转膜，将样品蛋白湿转至NC膜上。封闭后加入稀释后的抗体依次进行一抗孵育(抗体浓度分别为HIF-1α、LCa、NCX抗体1∶1 000，SERCA2a抗体1∶2 000)和二抗孵育(各抗体浓度均为1∶5 000)，最后在暗室中进行ECL显色。显色结果拍照后采用灰度分析进行半定量分析。

1.8 Ca2+浓度动态变化测定 将细胞接种于专用的激光共聚焦培养皿，在培养箱内与10 μmol/L的fluo-4 AM(2 μl)避光37℃孵育30 min，孵育完毕后用HEPEs液漂洗3次，最后加入含钙的HEPEs液，通过激光共聚焦显微镜连续监测心肌细胞内Ca2+浓度变化，参照相关文献[4]设置参数，激发光为氩激光，波长488 nm，分辨率为512×512，扫描速度为400 Hz，选择时间序列xyt扫描模式，采图所需的总时间Duration为15 min，采集相邻两帧图像的时间间隔为1.5 s，在40倍长工作距离的物镜下动态观察Fluo 4-AM指示Ca2+的变化。图像采用软件IDL处理，钙荧光量⊿F/F0=(F-F0)/F0(F和F0分别代表某一时间点的荧光强度和本底的荧光强度)。

表2 RT-PCR寡核苷酸引物及扩增条件

1.9 统计学方法分析 所有实验数据以均数±标准差表示，应用SPSS 17.0软件进行统计分析，多组样本均数比较采用单因素ANOVA分析和LSD多重比较法。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 胎鼠心肌细胞原代培养 在含5%CO2，3% O2，92% N2混合气体的低氧培养箱内37℃培养24 h后，于40×显微镜下可见心肌细胞贴壁生长，初为圆形，后变为梭形，单个细胞开始搏动。细胞逐渐在培养板铺展，伸出伪足，相互接触交织成网(见图1)。

图1 心肌细胞原代培养(40×)

2.2 与药物共同作用后 分组加入药物后培养24 h，40×显微镜下观察细胞生长情况，DMOG作用下，细胞生长活跃，收缩有力，Acriflavine作用下，细胞生长缓慢，且收缩减弱(见图2)。

2.3 荧光实时定量PCR检测各基因mRNA表达量 RT-PCR结果显示HIF-1α的mRNA表达量DMOG组较对照组显著升高，Acriflavine组较对照组和DMOG组显著降低，TCa的mRNA表达量DMOG组较Acriflavine组显著升高、NCX的mRNA表达量DMOG组较对照组显著升高，Acriflavine组较对照组和DMOG组显著降低，Rynaodine受体的mRNA表达量Acriflavine组较对照组显著降低，DMOG组较Acriflavine组显著升高，SERCA2α的mRNA表达量Acriflavine组较对照组和DMOG组显著升高(P<0.05，n=5)，见表3。

2.4 蛋白免疫印迹分析各基因蛋白水平 Westernblot结果显示HIF-1α的蛋白表达量DMOG组较对照组及Acriflavine组均显著升高，LCa的蛋白表达量DMOG组较对照组及Acriflavine组显著升高(P<0.05，n=5)，见表4。蛋白电泳见图3。

图3 Western-blot 检测各基因蛋白表达

图2 药物作用后的心肌细胞(40×)

HIF-1αLCaTCaNCXRynaodine受体SERCA2α对照组1*111*1*1*DMOG组1.862±0.516*3.664±3.1101.736±0.976*1.814±0.652*1.123±0.191*2.539±0.769*Acriflavine组0.261±0.114*2.684±3.5270.242±0.270*0.300±0.149*0.282±0.114*16.577±6.767*

注：*表示组间两两比较有统计学意义P<0.05。

表4 Western-blot检测各基因蛋白表达

注：*表示组间两两比较有统计学意义P<0.05。

图4 心肌细胞钙瞬变

2.5 Ca2+浓度测定 激光共聚焦显微镜下可见钙瞬变，见图4。测量钙瞬变荧光量结果显示：DMOG组(14.054±3.236)显著大于对照组(8.062±1.350)和Acriflavine组(1.708±0.175)，(P<0.001，n=12)，见图5。

注：*表示组间比较有显著性差异P<0.001。图5 钙瞬变荧光量测定

3 讨 论

HIF-1是一个由氧敏感的α亚基和结构性表达的β亚基组成的异源二聚体。HIF-1β在细胞内的表达水平相对稳定，而HIF-1α的活性和表达水平受氧浓度的影响[5]。HIF-1α是细胞最早感受缺氧刺激的因子之一，常氧条件下HIF-1无DNA结合活性，而在低氧条件下其表达显著升高[6]。常氧下HIF-1α被脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase,PHD)作用后,经泛素-蛋白酶体途径迅速被降解；低氧下PHD受到抑制，HIF-1α稳定性增强，转移到细胞核与HIF-1β形成HIF-1，作用于靶基因的缺氧反应元件，激活转录过程，其调控基因涉及胎儿心脏发育的多个环节[7]。

心肌细胞内Ca2+转运与心功能密切相关。尽管胎儿心肌细胞肌质网(sarcoplasmic reticulum，SR)的Ca2+储备较少，但是SR仍然是钙诱导钙释放(calcium induced caldium release，CICR)机制中Ca2+释放和回收的重要细胞器。通过Ca2+通道进入细胞内的Ca2+作用于SR膜上的Ryanodine受体，启动 CICR机制，SR释放Ca2+，与细胞外进入的Ca2+一起产生钙瞬变，促进肌丝的滑动，发生心肌收缩现象；达到钙瞬变的峰值后，SERCA2a、 NCX等转运蛋白将胞浆内增多的Ca2+回收到SR内或泵出细胞外，使胞浆内Ca2+浓度迅速下降，肌丝滑动复员，心肌舒张[8]。Ryanodine受体参与了心肌的兴奋收缩耦联、心脏起搏和心率失常的过程，维持了心肌细胞ATP的生产和生存[9]，其表达随着HIF-1活性的增加而上调。SERCA2a基因在钙回摄中有重要作用，在SERCA2a编码基因的启动子上有HIF-1结合的缺氧反应元件，研究显示低氧和HIF-1抑制胚胎心肌细胞SERCA2a的表达和活性[10]。NCX在心肌细胞膜上是一个非ATP依赖的双向钙离子转运蛋白，低氧下细胞内氢离子增多，促进钠氢交换和NCX转运，增加Ca2+内流，细胞内Ca2+超载是缺血心肌在再灌注过程中细胞凋亡、坏死、以及心功能降低的重要原因。

在既往研究[11-15]的基础上，笔者使用DMOG来减少HIF-1α的降解，促进HIF-1的活性，而Acriflavine可以干扰HIF-1α和HIF-1β的结合，抑制HIF-1的活性。经本研究分析，DMOG过度激活HIF-1，使Ca2+通道及Ryanodine受体表达增强，抑制了SERCA2a的表达，降低SR摄取Ca2+的能力，同时上调NCX的表达，NCX促进Ca2+内流，减少Ca2+排出，从而产生Ca2+超载，激活Ca2+依赖的蛋白酶，影响心肌收缩蛋白的功能，产生心功能不良。相反，Acriflavine抑制了HIF-1的活性，Ca2+通道及Ryanodine受体表达减弱，SERCA2a的表达上调，SR摄取Ca2+的能力增强，钙瞬变现象不明显，减少心功能损害。

综上所述，在低氧条件下，DMOG过度激活HIF-1，使胎鼠心肌细胞内Ca2+超载明显，Acriflavine抑制HIF-1活性，减轻胎鼠心肌细胞Ca2+超载。因此，笔者认为HIF-1在调节低氧条件下的胎鼠心肌细胞内Ca2+的转运发挥重要作用，抑制HIF-1活性可以对未成熟心肌起保护作用。

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Effects of hypoxia-inducible factor-1 on intracellular calcium transport in fetal rat cardiomyocytes under hypoxia

Zhang Li, Deng Chun-yu, Kuang Su-juan, Zhang Xiao-hua, Zhuang Jian, Zhou Cheng-bin

GuangdongCardiovascularInstitute,DepartmentofCardiovascularSurgeryofGuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,China

ZhouCheng-bin,Email:zcbwwww@163.com

Objective This study aimed to investigate the effects of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) on intracellular calcium (Ca2+) transport in fetal rat cardiomyocytes under hypoxia and to explore new methods of myocardial protection. Methods Cardiomyocytes from Sprague-Dawley (SD) rat aged 14～18 days were isolated and placed in a tri-gas incubator containing 5% CO2, 3% O2, and 92% N2. Cell culture was maintained at 37℃ for 24 h and divided into , control group, the group treated with HIF-1 agonist (DMOG group), and the group treated with HIF-1 inhibitor (Acriflavine group). Real-time fluorescent quantitative PCR (RT-PCR) and Western blotting were used 24 hours after treatment to detect the mRNA and protein expression of HIF-1α, L-type Ca2+channels, T-type Ca2+channels, sodium-calcium exchanger (NCX), ryanodine receptors, and Ca2+-ATPase of sarcoplasmic reticulum (SERCA2a) . The change of intracellular Ca2+concentration in cardiomyocytes was monitored by a laser scanning confocal microscope.

Results mRNA expression of HIF-1α in the DMOG group was significantly higher and that of Acriflavine group was lower than control group. T-type Ca2+channels mRNA in the DMOG group was higher than Acriflavine group. DMOG group had a increased level of NCX, where as the Acriflavine group showed a significantly reduced level. Acriflavine group had lower expression of ryanodine receptors but higher SERCA2a mRNA expression (P<0.05, n=5). Western blotting results showed an enhance dexpression of HIF-1α and L-type Ca2+channels in DMOG group. (P<0.05, n=5). The amount of calcium fluorescence in DMOG group was significantly higherthan control and Acriflavine group (P<0.001, n=10). Conclusions Under hypoxia, DMOG over activates HIF-1 and can lead to significant intracellular Ca2+overload inside cardiomyocytes of fetal rats. Acriflavine is capable of inhibiting the activity of HIF-1 and reducing the intracellular Ca2+load inside the cardiomyocytes,which may protect immature myocardium.

Hypoxia；Hypoxia-inducible factor-1；SD rat fetus；Cardiomyocyte；Calcium transport

10.13498/j.cnki.chin.j.ecc.2017.02.12

国家自然科学基金项目(81370274)

510080 广州，南方医科大学，广东省心血管病研究所，广东省华南结构性心脏病重点实验室(张 力，周成斌)；广东省人民医院医学研究中心，广东省心血管病研究所(邓春玉，邝素娟)；广东省心血管病研究所，广东省华南结构性心脏病重点实验室，广东省医学科学院(章晓华，庄 建)

周成斌，E-mail: zcbwwww@163.com

2016-12-22)

2017-01-16)