不同中和剂对植物乳杆菌LP-C冻干菌粉制备的影响

谢万勇，鲍志宁，黄秀敏，李学优，文国波

(广州市微生物研究所，广东 广州，510000)

不同中和剂对植物乳杆菌LP-C冻干菌粉制备的影响

谢万勇，鲍志宁*，黄秀敏，李学优，文国波

(广州市微生物研究所，广东 广州，510000)

研究了氨水(NH3·H2O)、氢氧化钠(NaOH)及碳酸钠(Na2CO3)作为发酵中和剂对植物乳杆菌LP-C(以下简称LP-C)冻干菌粉制备的影响。研究中对高细胞密度培养过程中的活菌数、碱液消耗速率、细胞长度及冻干过程中的冻干存活率等参数进行了监测。结果表明：(1)在高细胞密度培养阶段，使用Na2CO3作为中和剂时，培养终点活菌数最高，可达到(1.31±0.08)×1010CFU/mL；各实验组碱液消耗速率变化趋势基本一致，均是在培养前期0～6 h快速增长，之后逐步下降；各实验组菌体长度均随培养时间推移逐渐减小，至培养终点，Na2CO3实验组细胞长度最小，为(1.05±0.13)μm；(2)在离心、冻干后，Na2CO3实验组获得的冻干菌粉活菌数最高，为(5.17±0.27)×1011CFU/g，冻干存活率最高，为(89.31±0.74)%。由此可以得出，Na2CO3更合适作为中和剂应用于LP-C冻干菌粉的制备，碱液消耗速率可作为判断LP-C生长情况的间接指标，较小的细胞形态更利于提高培养液活菌数和冻干存活率。

植物乳杆菌；中和剂；细胞长度；冻干菌粉；高细胞密度培养

益生菌(Probiotics)具有调节肠道菌群平衡，预防和治疗腹泻，缓解肠道炎症，治疗乳糖不耐症，激活机体免疫系统等多方面的生理功能[1-4]。随着生物技术的不断发展，市场需求的稳定增加，益生菌在食品、保健、医药、农业及畜牧业等方面都有不同程度的研究应用进展[5-7]。而随着美国发布“国家微生物组计划(National Microbiome Initiative, NIMI)”，更多种类的益生菌及其作用机理将会被探讨和研究。国际组织也越发重视生物保健益生菌制剂在不同领域的开发以及制剂安全性的探索。

随着高细胞密度培养(High Cell Density Culture，HCDC)、分离和冷冻干燥技术的发展，标准化、高稳定性的益生菌冻干菌粉为益生菌的广泛应用提供了桥梁和保证。因此对于如何提高益生菌培养液活菌数、冻干存活率、生产效率及存储稳定性已成为益生菌工业生产研究的热点。因此控制发酵过程中pH值稳定，已成为实现HCDC的普遍手段。吕兵等[8]研究表明，在保加利亚乳杆菌HCDC过程中pH的控制可解除乳酸浓度不断提高对乳酸菌自身增殖的抑制作用，从而获得更高浓度的细胞培养物。Antonis等[9]研究表明，发酵过程中控制恒定的pH值，有利于提高鼠李糖乳杆菌LGG培养过程中糖代谢的速率，进而可提供足够的ATP来保持细胞活性，加快菌体增殖和可提高LGG在冻干过程中的存活率。同时稳定的pH控制也有利于提高HCDC获得产物的稳定性，如表达外源蛋白的稳定性、收获活细胞的活性等[10]。目前尚未有对于不同中和剂对益生菌HCDC过程及后续冻干菌粉制备影响的报道。

本课题以植物乳杆菌LP-C(以下简称LP-C)为研究对象，对比在控制恒定pH的HCDC中，NH3·H2O、NaOH及Na2CO3三种中和剂对冻干菌粉制备的影响。研究中通过考察冻干菌粉制备过程中HCDC活菌数变化、菌体形态变化、碱液消耗速率及冻干存活率等参数，以期寻找出一种可提高LP-C HCDC活菌数和冻干存活率的中和剂并初步解析其作用机理，为益生菌的工业生产提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 菌种

LP-C(lactobacillusplantarumC)，由广东省微生物种质资源库保藏(GW-4-1201-1612-04)。

1.2 主要仪器与试剂

主要仪器：50L机械搅拌发酵罐，江苏丰泽生物工程设备制造有限公司；pH电极，METTLER TOLEDOCo.Ltd；超净工作台，江苏净化设备有限公司；恒温培养箱，上海一恒科学仪器股份有限公司；显微镜重庆奥特光学仪器有限公司；管式离心机，上海浦东天本离心机械有限公司；冻干机，杭州创意冷冻干燥设备有限公司。

主要试剂：脱脂乳粉，新西兰恒天然乳品有限公司，食品级；大豆分离蛋白，山东万得福实业集团有限公司，食品级；葡萄糖，秦皇岛骊骅淀粉股份有限公司，食品级；酵母粉，湖北安琪酵母股份有限公司，食品级；VC，山东西唐生物科技有限公司，食品级；司盘S-80，广州市汇科科技，食品级，其他试剂为分析纯。

1.3 培养基

1.3.1 发酵培养基[11]

脱脂乳粉(50 g/L)、大豆分离蛋白(8 g/L)、葡萄糖(20 g/L)、酵母浸膏(8 g/L)、NaCl(23 g/L)、MgSO4·7H2O(2 g/L)、MnSO4·H2O(0.05 g/L)、司盘S-80(1 g/L)、氢氧化胺(0.5 g/L)，调节pH5.80,121 ℃灭菌20 min。

1.3.2 冻干保护剂[11]

脱脂乳粉(20 g/L)，谷氨酸钠(20 g/L)，海藻糖(40 g/L)，麦芽提取物(30 g/L)。

目前虽然尚未研发出针对非洲猪瘟的疫苗。但高温、消毒剂可以有效杀灭病毒，因此，确保生物安全成为最重要的防线。泔水是一种方便、成本低廉，但存在高风险的饲料，可能含有多种病原。多项研究表明，食用被病毒污染的泔水是非洲猪瘟传播的重要方式之一。因此，必须禁止用泔水和含有猪肉的食物残羹饲喂生猪。

1.4 方法与步骤

1.4.1 LP-C冻干菌粉制备工艺流程[11]

1.4.2 冻干粉存活率计算

(1)

式中：FS为冻干存活率，%；C1为冻干菌粉活菌数，CFU/g；M1为冻干菌粉质量，g；C2为冻干前菌悬液活菌数，CFU/g；M2为冻干前菌悬液质量，g。

1.4.3 活菌计数

参考国标GB4789.35—2010。

(2)

式中：V碱，碱液消耗速率，g/min；M1，碱液初始质量，g；M2，培养一定时间后碱液质量，g，t，培养时间间隔，min。

1.4.5 细胞长度测量

在光学显微镜100倍油镜下，采用OPTPro金相系统分析软件进行细胞长度测量与记录，每个样品做3个镜片，每个镜片测量10个细胞的长度，单位μm。

1.4.6 分析方法

作图软件采用Excel2010，数据处理采用SPSS23.0。

2 结果与讨论

2.1 不同中和剂对LP-C HCDC过程中细胞增殖的影响

图1显示了不同中和剂对LP-C HCDC过程中细胞增殖的影响，可以看出各实验组菌体增殖趋势基本一致，在培养前0～4.5h，菌体快速增殖，处于对数生长期；在培养后4.5～9 h，菌体增殖速度缓慢，进入平稳期；至培养终点，Na2CO3实验组活菌数最高，达到(1.31±0.08)×1010CFU/mL，与NH3·H2O实验组及NaOH实验组差异显著(P<0.05)。

图1 不同中和剂对LP-C HCDC过程中细胞增殖的影响Fig.1 Effect of cell proliferation in the process of LP-CHCDC with different neutralizer

这是由于相比与NaOH和NH3·H2O，Na2CO3作为中和剂时，其与乳酸反应后产生CO2，而CO2的存在将进一步降低培养液中的溶氧水平，进而更利于属于兼性厌氧型LP-C的生长。而NH3·H2O作为中和剂的同时也是一种速效氮源，在培养前期，菌体生长缓慢，产酸量低，NH3·H2O添加量少，此时培养液中碳氮比基本维持在初始培养基的水平，菌体增殖正常；但是在进入对数后期后，菌体快速增殖，原始培养基中碳源氮源不断消耗，产酸速率加快，NH3·H2O添加量增加，增加了培养液中氮源，从而降低了培养液的碳氮比，进而不利于菌体的进一步增殖。这与高磊等[12]研究类似，其在研究不同碳氮比对乳酸菌生长的影响时发现较高的碳氮比(C∶N≥10)更适合乳酸菌的生长。NaOH作为中和剂时，随着发酵的进行，培养液中Na+浓度不断提高，至培养中后期，过高的盐离子将抑制菌株的生长[13]。

2.2 不同中和剂对LP-C HCDC过程中碱液消耗速率的影响

微生物发酵是一个不断消耗培养基中的营养成分，经过微生物细胞代谢合成菌体生长所需产物的过程，而营养成分的减少、代谢产物的增加将使培养液中的酸度不断变化，因此培养液酸度作为微生物发酵过程中一个重要的监测参数，其可以间接的反映发酵液中营养成分的消耗情况、代谢产物的生成情况及菌体的增殖情况[14]。而在恒定pH高细胞密度培养过程中，与酸度变化直接相关的即中和剂的添加速率和添加量，可根据中和剂的添加情况判断菌体生长情况。

图2显示了不同中和剂对LP-C HCDC过程中碱液消耗速率的影响，可以看出各实验组碱液消耗速率变化趋势基本一致，并与菌体生长的变化趋势基本一致，在培养前0～2h，菌体生长处于迟滞期，碱液消耗速率缓慢；在培养2～6.5 h，菌体生长处于对数期，碱液消耗速率加快；在培养6.5～9.5 h，菌体生长处于平稳期，碱液消耗速率缓慢下降。对培养过程中碱液消耗的记录及乳酸产量的计算(表1)，可以看出，NH3·H2O实验组与Na2CO3实验组乳酸生成量没有显著差异，NaOH实验组乳酸生成量最低与其余两个实验组存在显著性差异，由此可以看出NaOH实验组碳源代谢率最低，而结合高细胞密度培养活菌数来看，NaOH实验组的放罐活菌数也是最低，进而可以看出在LP-C的高细胞密度培养过程中，碳源的高效率代谢对活菌数的增加至关重要。

图2 不同中和剂对LP-C HCDC过程中碱液消耗速率的影响Fig.2 Effect of alkali consumption rate in the process of LP-CHCDC with different neutralizer

项目碱液消耗量/mol乳酸生成量/molNH3·H2O实验组10.19±0.18a10.19±0.18bNaOH实验组9.39±0.22b9.39±0.22aNa2CO3实验组4.99±0.09c9.99±0.90b

注：a、b、c表示同一列数据差异显著(P<0.05)。

2.3 不同中和剂对LP-C HCDC过程中菌体形态的影响

微生物细胞在不同的培养基中[15]、不同的生长阶段[16]及不同的生长环境中[17]，细胞形态会不同。图3和图4显示了不同中和剂对LP-C HCDC过程中细胞长度的影响，由图可以看出，3个实验组细胞大小均随培养时间的推移，菌体长度在逐步减小；在培养前1.5～6.0h(对数生长期)，细胞长度迅速减小，在培养6.0～9.5h(稳定期)，细胞长度减小速度减慢。相比于培养1.5h时，各实验组HCDC结束时，细胞长度分别下降了(62.05±0.35))%、(62.00±0.31)%和(67.81±0.18)%，并且至培养终点时，Na2CO3实验组细胞长度最小，为(1.05±0.13)μm，与其余两个实验组存在显著性差异。由此可以看出，3个实验组均随培养时间的推移细胞长度逐渐变小，分析可能是随着培养时间的推移，培养液中细胞总量不断增加，培养液中营养成分不断被消耗，至培养后期菌体之间营养和空间竞争加剧，细胞生长不是足够充分；并且随着培养时间的推移，培养液中乳酸盐浓度不断增加，培养液渗透压也不断增加，为了维持细胞内外渗透压平衡，细胞失水收缩，进而细胞体积也会随之减小[18]。

图3 不同中和剂对LP-C HCDC过程中细胞长度的影响Fig.3 Effect of cell length in the process of LP-C HCDC with different neutralizer

图4 不同中和剂HCDC过程中不同时期菌体镜检图Fig.4 The microscopic examination of the bacteria in the process of HCDC with different neutralizer in different periods

2.4 不同中和剂对LP-C冻干菌粉制备的影响

离心菌体分离及冷冻干燥获得菌粉作为益生菌菌粉制备过程中的关键步骤，对其品质有着重要影响。从表2中可以看出，3组实验中的菌泥重量、菌悬液重量及冻干菌粉重量均没有显著差异；冷冻干燥后，Na2CO3实验组冻干存活率最高，为(89.31±0.74)%，与NH3·H2O实验组及NaOH实验组存在显著差异；并且获得冻干菌粉的活菌数也是Na2CO3实验组最高，达到(5.17±0.27)×1011cfu/g，与NH3·H2O实验组及NaOH实验组存在显著差异。由此可以看出，不同中和剂的使用不仅对LP-C HCDC过程存在影响，而且对其后期菌粉制备也有较大影响，使用Na2CO3作为中和剂时，HCDC获得菌体细胞活力更高，在整个冻干菌粉制备过程中活细胞损失率更小。结合HCDC过程中细胞形态的变化及冻干菌粉细胞长度来看，长度更小的细胞更利于提高冷冻干燥过程的冻干存活率和获得活菌数更高的冻干菌粉。Carvalho等[19]研究表明，在冻干过程中，短小的细胞受到冰晶的损伤更小，更利于提高冻干存活率和保持细胞活力。并且Martin等[20]在研究不同培养基组成对嗜酸乳杆菌NCFM HCDC的影响时，发现短小的细胞比长细胞更加稳定，并且在冻干及储存过程中的稳定性更高。本课题首次将细胞长度变化与LP-CHCDC过程及冻干过程相结合，结果表明细胞长度可作为益生菌冻干菌粉制备过程中一个重要的参数进行监测。

表2 离心及冻干过程中数据记录

注：a、b、c表示同一列数据差异显著(P<0.05)。

表3 离心及冻干过程中活菌数记录

注：a、b、c表示同一列数据差异显著(P<0.05)。

图5 不同中和剂HCDC冻干菌粉镜检图Fig.5 The microscopic examination of the freeze-dried bacteria powder in the process ofhigh density culture with different neutralizer

3 结论

在50L发酵罐水平探讨了NH3·H2O、NaOH及Na2CO3作为中和剂时对LP-C冻干菌粉制备的影响。通过对制备过程中活菌数、pH变化率、碱液消耗速率、细胞形态变化及冻干存活率等参数分析可得出以下结论：(1)3种中和剂中Na2CO3更适合作为LP-C HCDC的中和剂，相比于NH3·H2O和NaOH，使用Na2CO3时的安全性更高、成本更低，将更加有利于LP-C的工业化生产；(2)在LP-C HCDC过程中可以碱液消耗速率作为移种、补料及培养终点的参数指标；(3)在LP-C HCDC过程中，细胞长度在逐渐变小，并且较小的细胞形态有利于提高益生菌培养液活菌数和冻干存活率。

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Effect of different fermentation neutralizer on preparation ofLactobacillusplantarumLP-C lyophilization powder

XIE Wan-yong, BAO Zhi-ning*, HUANG Xiu-min, LI Xue-you, WEN Guo-bo

(Guangdong Institute of Microbiology, Guangzhou 510000, China)

This article studied the effect of ammonia (NH3·H2O), sodium hydroxide (NaOH) and sodium carbonate (Na2CO3) as fermentation neutralizer on preparation of plant Lactobacillus LP-C lyophilization powder. In this study, viable count, neutralizer consumption rate, cell length and lyophilization survival rate were be monitored during the process of high density culture and lyophilization. The results showed that, the highest number of living bacterium reached (1.31+0.08)×1010CFU/mL at the stage of high cell density cultivation (HCDC) with Na2CO3as a neutralizer. The change trend of alkali consumption rate was substantially identical among all experimental groups, which was fast at the early stage of culture (0-6 h) and decline gradually at the late culture stage (6-9.5 h). The length of cells in each experiment decline gradually during the process of HCDC, and the minimum cell length reached (1.05 + 0.13) μm when using Na2CO3as a neutralizer. After centrifugation and lyophilization, the highest number of living bacterium of lyophilization powder reached (5.17±0.27)×1011and the highest lyophilization survival rate reached (89.31±0.74)% when using sodium carbonate as a neutralizer. In conclusion, sodium carbonate was a more suitable neutralizer for lyophilization powder preparation of LP-C. Alkali consumption rate can be used as indirect indicator of growth of LP-C. Smaller cell length is more conducive to improve the number of living bacterium during fermentation and survival rate after lyophilization.

Lactobacillusplantarum；cell length；neutralizer；lyophilization powder; high cell density culture

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705020

硕士研究生(鲍志宁博士为通讯作者,E-mail：janinebao@gmail.com)。

广州市科技计划项目产学研协同创新联盟专题“益生菌资源库建设及产业化关键技术研究和应用示范”；广东省省级科技计划项目技术交易体系与科技服务网络建设领域“广州市生物科技园科技创业服务平台建设”(2015B040403004)

2016-10-11，改回日期：2017-01-07