脱钙预处理对提高浓缩乳蛋白溶解性的影响

刘大松，余韵，李珺珂，徐雨婷，王淼，周鹏

(江南大学，食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，食品安全与质量控制协同创新中心，江苏 无锡，214122)

脱钙预处理对提高浓缩乳蛋白溶解性的影响

刘大松，余韵，李珺珂，徐雨婷，王淼*，周鹏

(江南大学，食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，食品安全与质量控制协同创新中心，江苏 无锡，214122)

以脱脂乳为原料，通过超滤、洗滤、离子交换和喷雾干燥制备了脱钙率为0%、11%、19%、27%和37%的浓缩乳蛋白(milk protein concentrate, MPC)，并在35 ℃加速贮藏4个月，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、激光共聚焦、激光粒度仪等方法分析了MPC中可溶性蛋白的含量、组成及其溶解液的微观结构和粒径分布，旨在探讨脱钙程度对MPC溶解性和贮藏稳定性的影响。脱钙MPC的初始溶解度都在95%以上，且随脱钙程度的增加而略有提高。在贮藏过程中，0%脱钙MPC的溶解度显著降低；11%脱钙MPC的溶解度随贮藏时间增加而显著降低；19%～37%脱钙MPC的溶解度在贮藏期内几乎不变。MPC溶解度的降低，主要是由酪蛋白聚集所致。MPC的脱钙率越高，其在水中的分散程度越高，且分散程度随贮藏时间降低的速度越慢。综上所述，当脱钙率达到19%及其以上时，MPC具有良好的溶解性和贮藏稳定性。

浓缩乳蛋白；脱钙；溶解性；粒径分布

浓缩乳蛋白(MPC)是脱脂牛乳经过超滤和洗滤脱除部分乳糖和盐之后，再通过真空浓缩和喷雾干燥脱水，所得到的一类高蛋白粉[1-2]。MPC中蛋白质的含量介于40%～90%之间，这是由脱脂乳超滤和洗滤的程度决定的。膜分离工艺具有非热、高效、绿色等特点，因而MPC较好地保持了牛乳中蛋白质原有的结构和性质。此外，MPC的蛋白质组成与牛乳几乎完全相同，即含酪蛋白与乳清蛋白，且两者的比例约为4∶1。MPC是一种相对新型的功能性蛋白配料，具有高蛋白、低脂肪、低乳糖等特点，并具有良好的风味和口感，因而被广泛的应用于酸奶、乳酪、婴幼儿食品、烘焙食品、运动营养食品、功能性饮料等食品的研发和生产[3]。

目前，MPC在应用过程中存在的一个突出问题是其溶解性较差，主要表现为：在室温条件下，新生产的MPC，其溶解度较低；在贮藏过程中，MPC的溶解度会进一步降低[2,4-6]。MPC的蛋白含量越高，其溶解性较差的问题越严重。较低的溶解度会影响MPC的其它功能性质，如凝胶性、起泡性、乳化性、热稳定性等，从而限制了MPC在食品工业中的应用[1]。升高溶解温度、延长溶解时间、超声和均质辅助等物理方法，均可提高MPC的溶解度，但这都会额外增加产品的生产成本[7]。前期研究表明，MPC溶解性较差的主要诱导机理是蛋白非共价聚集，即MPC中的钙离子会通过离子键介导蛋白之间产生非共价交联，从而降低MPC的溶解度[6,8-10]。

基于钙离子介导的蛋白非共价聚集机理，本论文采用离子交换树脂对脱脂乳的超滤截留液进行脱钙处理，并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、激光共聚焦(CLSM)、激光粒度分析仪等方法，探讨脱钙程度对MPC溶解度和贮藏稳定性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

优倍巴氏杀菌脱脂乳，上海光明集团；罗门哈斯Amberlite SR1L Na树脂，美国Dow’s化学品公司；异硫氰酸荧光素(FITC)，美国Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺、过硫酸铵，美国Amresco公司；高氯酸、浓HNO3、浓H2SO4、氧化镧、CaCl2、叠氮化钠、乙酸、甘氨酸，国药集团化学试剂有限公司；甘油、考马斯亮蓝R-250、β-巯基乙醇，上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 主要仪器

SPPM-24S-1超滤系统，厦门三达膜科技有限公司；Spectr AA 220原子吸收光谱分析仪，美国Varian公司；B-290喷雾干燥仪，瑞士步琪公司；S3500激光粒度仪，美国Microtrac公司；4TE/TEV水分活度仪，美国Aqualab公司；LSM-780激光共聚焦显微镜，德国Zeiss公司；Waters e2695 Separations Module高效液相色谱分析仪，美国Waters公司；Heraeus Multifuge XIR冷冻离心机，美国Thermo公司；C-MAG HS7磁力搅拌器，德国IKA集团；K1302凯氏定氮仪，上海晟声自动化分析仪器有限公司；SHP-250生化培养箱，上海森信实验仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 脱钙MPC的制备

在脱脂乳中加入0.01%叠氮化钠以防止微生物生长，采用10 kDa截留分子量的聚醚砜滤膜进行超滤，待体积浓缩3倍后，在截留液中补加水至原脱脂乳体积，经洗滤浓缩3倍后，再在相同条件下重复上述洗滤步骤2次，收集最终所得的截留液，并加入0.01%叠氮化钠。取1 kg截留液分别加入0、10、20、30、40 g离子交换树脂，在室温下搅拌2 h后，在进口温度135 ℃和出口温度75 ℃的条件下进行喷雾干燥，所得MPC分装于铝箔袋中，然后置于底部盛有饱和氯化镁溶液(0.32水分活度)的干燥器中，并将干燥器放置在生化培养箱中，35 ℃贮藏112 d。

1.3.2 钙和钠含量的测定

称取0.1 g脱钙MPC至250 mL高脚烧杯中，加入20 mL浓硝酸和5 mL高氯酸，高温消化至剩余体积约为2 mL，用超纯水定容至50 mL，取5 mL定容后样品与1 mL镧溶液(50 mg/mL)一起定容至50 mL，然后再采用原子吸收光谱法测定钙和钠含量[11]。

1.3.3 蛋白含量的测定

称取0.2 g脱钙MPC、0.2 g硫酸铜、4 g硫酸钾于消化管中，加入20 mL浓硫酸，高温消化至澄清透明。采用凯氏定氮法测定脱钙MPC中的蛋白含量，所用的蛋白质换算系数为6.38。

1.3.4 乳糖含量的测定

称取2.5 g脱钙MPC至50 mL容量瓶中，加入10 mL水，60 ℃水浴5 min，然后置于超声波振荡器中振荡10 min，用乙腈定容，静置10 min后，用0.45 μm有机滤膜过滤，所得滤液采用高效液相色谱法测定其乳糖含量，所用色谱柱为氨基柱。

1.3.5 溶解度的测定

称取0.75 g脱钙MPC，加入15 mL超纯水，在25 ℃搅拌30min，然后取5 mL溶解液在700 g条件下离心10 min，将上清液转移至干燥皿中，再另取5 mL溶解液直接置于干燥皿中，在105 ℃干燥10 h，所得上清液固形物质量占溶解液固形物质量的百分比即为溶解度[12]。

1.3.6 可溶性蛋白的电泳分析

取1.3.5中脱钙MPC的溶解上清液稀释10倍后，与样品缓冲液等体积混合，沸水浴3 min后冷却。浓缩胶和分离胶浓度分别为4%和13%，其所对应使用的电流分别为20和40 mA，上样量为25 μL。

1.3.7 溶解液的CLSM分析

取1.3.5中脱钙MPC的溶解液，采用FITC(0.01 mg/mL)标记，然后取200 μL标记样品置于玻底培养皿中，盖上盖玻片，即刻在488 nm激发波长下观测MPC粉末颗粒微观结构的变化。

1.3.8 溶解液的粒径分析

取1.3.5中脱钙MPC的溶解液，采用激光粒度仪测定其粒径分布，使用湿法分散单元，所设置的测试参数如下：颗粒形状为irregular，分散相折光系数为1.33，颗粒的折光系数为1.57。

2 结果与讨论

2.1.1 脱钙MPC的基本组成

脱脂乳经超滤和洗滤后，所得截留液的固形物含量为10.1%，蛋白质含量为9.0%。如表1所示，截留液经钠型阳离子交换树脂处理后，所得脱钙MPC的钙含量分别为2.7%、2.4%、2.2%、2%和1.7%，其脱钙率分别为0%、11%、19%、27%和37%。随着脱钙率的增加，脱钙MPC的钠含量也逐渐增加，分别为0.2%、0.5%、0.7%、0.9%和1.1%。阳离子交换树脂常用的离子形式为钠型和钾型，后者会导致脱钙MPC产生过重的小苏打碱味，而前者对脱钙MPC风味的影响较小[13]。脱钙MPC的蛋白质含量约为78%，对应于食品工业中常用的MPC80。脱钙MPC的水分活度保持在0.32～0.37，与商业MPC接近。脱钙MPC的乳糖含量约为5%，而脱脂乳粉的乳糖含量约为50%～55%[14]。乳蛋白粉在贮藏过程中的色泽变化主要是由美拉德反应所导致的，而脱钙MPC的乳糖含量较低，因而其在贮藏过程中的色泽变化不明显[15]。然而，随着脱钙率的增加，酪蛋白胶束逐渐解离成单体的酪蛋白分子和小分子质量的酪蛋白聚集体，因而脱钙MPC复溶液的浊度随脱钙率的增加而逐渐降低，当脱钙率达到37%及其以上时，脱钙MPC复溶液由乳白色转变为半透明状态，因而高脱钙率的MPC可用于半透明及透明乳饮料的研发和生产[16]。

表1 脱钙MPC的基本组成

注：同一列中小写字母不同代表对应的数据之间差异显著(P<0.05)。

2.1.2 脱钙MPC的溶解度

MPC良好的溶解性是实现凝胶性、乳化性、起泡性等其它功能性质的先决条件[17]。在工业生产中，通常要求MPC在常温条件下能够快速和完全的溶解。脱钙MPC在35 ℃条件下加速贮藏112 d的过程中，其溶解度随脱钙程度和时间的变化如图1所示。从图1中可以看出，未经脱钙处理的MPC，在贮藏0 d时，其溶解度为95%；贮藏28 d后，溶解度降为71%；贮藏56 d后，溶解度降低到44%；贮藏112 d后，溶解度降低至21%，相比贮藏0 d的样品，溶解度减少了74%。脱钙率为11%的MPC，在贮藏0、28、56、112 d后，其溶解度分别为97%、88%、76%、54%，在贮藏过程中溶解度减少了约40%。脱钙率为19%的MPC，在贮藏过程中，其溶解度从98%降低至91%，溶解度仅减少了7%；脱钙率为27%和37%的MPC，在贮藏过程中，其溶解度无明显变化，均保持在98%左右。这说明，MPC的脱钙率越高，其初始溶解度越高，且溶解度随贮藏时间降低的速度越慢；当脱钙率达到19%及其以上时，MPC具有良好的溶解性和贮藏稳定性。

图1 脱钙MPC在35 ℃贮藏条件下其溶解度随时间的变化Fig. 1 Changes in solubility of decalcified MPC during storage at 35 ℃

2.1.3 脱钙MPC中可溶性蛋白的电泳图

脱钙MPC在35 ℃条件下贮藏112 d的过程中，其可溶性蛋白随脱钙程度和时间的变化如图2所示。在贮藏0 d时，脱钙MPC的溶解液中主要含β-酪蛋白、α-酪蛋白和β-乳球蛋白，不同脱钙率MPC所对应的各蛋白条带的强度无明显差别，而且脱钙MPC的溶解液上清中，各蛋白条带的强度也无明显变化。贮藏28 d后，0%脱钙MPC的溶解液上清中，α-和β-酪蛋白所对应的条带显著变浅，β-乳球蛋白所对应的条带无明显变化；11%脱钙MPC的溶解液上清中，α-和β-酪蛋白所对应的条带略有变浅；19%、27%和37%脱钙MPC的溶解液上清中，各蛋白条带均无明显变化。贮藏56 d后，0%脱钙MPC的溶解液上清中，α-和β-酪蛋白所对应的条带只能模糊可见，β-乳球蛋白所对应的条带略有变浅；11%脱钙MPC的溶解液上清中，α-和β-酪蛋白所对应的条带显著变浅，β-乳球蛋白所对应的条带无明显变化；19%、27%和37%脱钙MPC的溶解液上清中，各蛋白条带均无明显变化。贮藏112 d后，0%脱钙MPC的溶解液上清中，α-和β-酪蛋白所对应的条带已完全消失，β-乳球蛋白所对应的条带显著变浅；11%脱钙MPC的溶解液上清中，α-和β-酪蛋白所对应的条带只能模糊可见，β-乳球蛋白所对应的条带略有变浅；19%、27%和37%脱钙MPC的溶解液上清中，各蛋白条带的变化不显著。这说明，MPC在贮藏过程中其溶解度的降低，主要是由酪蛋白的聚集导致的，而乳清蛋白的溶解度则是在贮藏后期才会轻微地降低。MPC的脱钙率越高，酪蛋白的溶解度随贮藏时间降低的速度越慢；当脱钙率达到19%及其以上时，酪蛋白保持良好的溶解性和贮藏稳定性。

2.1.4 脱钙MPC溶解液的CLSM图

脱钙MPC在35 ℃条件下贮藏112 d的过程中，其溶解液的微观结构随脱钙程度和时间的变化如图3所示。从图中可以看出，在贮藏0 d时，0%脱钙MPC的溶解液中仍有大量的颗粒物，11%脱钙MPC的溶解液中颗粒物相对较少，19%脱钙MPC的溶解液中仅有极少的颗粒物，而27%和37%脱钙MPC的溶解液中无颗粒物出现，呈现出均一的分散状态。脱钙MPC溶解液中的颗粒物对应于未分散开的MPC粉体颗粒，其呈现出中空的状态。脱钙率为0%和

图2 脱钙MPC在35 ℃贮藏条件下其可溶性蛋白的电泳图(CN-酪蛋白，Lg-乳球蛋白)Fig. 2 SDS-PAGE patterns of the soluble proteins in decalcified MPC stored at 35 ℃

图3 脱钙MPC在35 ℃贮藏条件下其溶解液的CLSM图Fig. 3 CLSM micrographs of reconstituted decalcified MPC stored at 35 ℃

11%的MPC，在贮藏过程中，其溶解液中颗粒物的数量逐渐增加，而且颗粒物的平均尺寸也随贮藏时间略有增加。脱钙率为19%的MPC，在贮藏28 d后，其溶解液中颗粒物略有增加；贮藏56 d和112 d后，其溶解液中颗粒物显著增加，但仍比0%和11%脱钙MPC的溶解液少。脱钙率为27%的MPC，在贮藏过程中，其溶解液中仅有极少的颗粒物出现。脱钙为37%的MPC，在贮藏过程中，其溶解液中无颗粒物出现，呈现出均一的分散状态。这说明，MPC的脱钙率越高，其在水中的分散程度越高，且分散程度随贮藏时间降低的速度越慢，该部分结果与MPC的溶解度随脱钙程度和贮藏时间而变化的趋势基本一致。

2.1.5 脱钙MPC溶解液的粒径分布图

图4 脱钙MPC在35 ℃贮藏条件下其溶解液的粒径分布图Fig. 4 Particle size distribution of reconstituted decalcified MPC stored at 35 ℃

脱钙MPC在35 ℃条件下贮藏112 d的过程中，其溶解液的粒径分布随脱钙程度和时间的变化如图4所示。在贮藏0 d时，未经脱钙处理的MPC，其溶解液的粒径分布主要集中在10～100 μm之间，在0.01～0.1 μm之间出现了小峰；脱钙率为11%的MPC，其溶解液的粒径分布也主要集中在10～100 μm之间，但峰面积比例略微变小，并向低粒径区域偏移，且在1μm附近出现了极小的峰，在0.01～0.1 μm之间出现了较大的峰；19%脱钙MPC的溶解液，在10～100 μm之间的粒径分布比例显著变小，而在0.01～0.1 μm之间的粒径分布比例显著增加；27%和37%脱钙MPC的溶解液，其粒径分布主要集中在0.01～0.1μm之间，在0.1～100μm出现了极小的峰。脱钙率为0%和11%的MPC，在贮藏过程中，其溶解液的粒径分布主要出现在大于10 μm的区域内，且随贮藏时间逐渐向大粒径区域偏移。脱钙率为19%的MPC，在贮藏28 d和56 d后，其溶解液在0.01～0.1 μm之间的粒径分布比例逐渐变小，在10～100 μm之间的粒径分布比例逐渐增加，且向大粒径区域偏移；贮藏112 d后，其溶解液的粒径分布主要集中在大于10 μm的区域内。脱钙率为27%的MPC，在贮藏过程中，其溶解液在0.01～0.1 μm之间的粒径分布比例逐渐变小，在10～100 μm之间的粒径分布比例逐渐增加，但粒径分布仍比0%、11%和19%脱钙MPC的溶解液小。脱钙率为37%的MPC，在贮藏28 d和56 d后，其溶解液的粒径分布主要集中在0.01～0.1 μm之间，在0.1～10 μm之间出现了极小的峰；贮藏112 d后，其溶解液的粒径分布主要集中在大于10 μm的区域内，在0.01～1 μm之间出现了极小的峰。这说明，MPC的脱钙率越高，其在水中的分散程度越高，且分散程度随贮藏时间降低的速度越慢，该部分结果与CLSM显示的结果基本一致。

MPC的溶解是一个复杂过程，通常可分为润湿、沉降、分散和溶解4个阶段。在润湿阶段，水分子首先浸润粉体颗粒表面，并逐渐向粉体颗粒内部渗透；在沉降阶段，粉体颗粒自重增加，下沉入液体中；在分散阶段，粉体颗粒被分散成更小的细粒并均匀分布于体系中；在最后的溶解阶段，水分子的作用使小颗粒再进一步被分散，形成溶液、乳浊液或悬浊液[18]。该过程中任何一个阶段的延迟都可能会降低MPC的溶解性能。MPC中钙离子的脱除，减少了蛋白质之间由离子键介导的非共价交联，从而加速了MPC的溶解过程。

3 结论

以脱脂乳为原料，通过超滤、洗滤、离子交换和喷雾干燥等系列单元工艺，制备了脱钙率为0%、11%、19%、27%和37%的MPC。脱钙MPC的初始溶解度都在95%以上，且随脱钙程度的增加而略有提高。在35 ℃加速贮藏4个月后，未脱钙MPC的溶解度显著降低；11%脱钙MPC的溶解度随贮藏时间增加而明显降低；19%～37%脱钙MPC的溶解度在贮藏期内几乎不变。MPC溶解度的降低，主要是由酪蛋白聚集导致的。MPC的脱钙率越高，其在水中的分散程度越高，且分散程度随贮藏时间降低的速度越慢。综上所述，当脱钙率达到19%及其以上时，MPC具有良好的溶解性和贮藏稳定性，这说明离子交换脱钙可作为一种潜在的手段来改性MPC，以促进其在食品工业中的应用。

[1] HAVEA P. Protein interactions in milk protein concentrate powders [J]. International Dairy Journal, 2006, 16(5):415-422.

[2] SINGH H. Interactions of milk proteins during the manufacture of milk powders [J].Lait, 2007, 87(4-5):413-423.

[3] 孙颜君. 乳蛋白浓缩物加工特性及其应用研究进展[J]. 食品工业, 2014, 35(7):210-215.

[4] MIMOUNI A, DEETH H C, WHITTAKER A K, et al. Rehydration process of milk protein concentrate powder monitored by static light scattering [J]. Food Hydrocolloids, 2009, 23(7):1 958-1 965.

[5] SCHUCK P, PIOT M, MEJEAN S, et al. Dehydration of an ultra-clean milk andmicellar casein enriched milks [J]. Lait, 1994,74(1):47-63.

[6] BALDWIN A J, TRUONG G N T. Development of insolubility in dehydration of dairy milk powders [J]. Food andBioproducts Processing, 2007, 85(3):202-208.

[7] 孙颜君. 乳蛋白浓缩物 (MPC) 的生产及其在搅拌型酸奶中的应用研究 [D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2013.

[8] MIMOUNI A, DEETH H C, WHITTAKER A K, et al. Investigation of the microstructure of milk protein concentrate powders during rehydration: alterations during storage [J]. Journal of Dairy Science, 2010, 93(2):463-472.

[9] DALGLEISH D G, CORREDIG M. The structure of the casein micelle of milk and its changes during processing [J]. Annual Review of Food Science and Technology, 2012, 3:449-467.

[10] BHASKAR G V, SINGH H, BLAZEY N D. Milk protein products and processes [P].America, 2013, US7157108.

[11] LIU D Z, DUNSTAN D E, MARTIN G J O. Evaporative concentration of skimmed milk: effect on casein micelle hydration, composition, and size [J]. Food Chemistry, 2012, 134(3):1 446-1 452.

[12] ESHPARI H, TONG P S, CORREDIG M. Changes in the physical properties, solubility, and heat stability of milk protein concentrates prepared from partially acidified milk [J]. Journal of Dairy Science, 2014, 97(12):7 394-7 401.

[13] RANJITH H M P, LEWIS M J, MAW D. Production of calcium-reduced milks using an ion-exchange resin [J]. Journal of Dairy Research, 1999, 66(1):139-144.

[14] SINGH H. Interactions of milk proteins during the manufacture of milk powders [J].Lait, 2007, 87(4):413-423.

[15] MISTRY V V. Manufacture and application of high milk protein powder [J]. Lait, 2002, 82(4):515-522.

[16] XU Y T, LIU D S, YANG H X, et al. Effect of calcium sequestration by ion-exchange treatment on the dissociation of casein micelles in model milk protein concentrates [J]. Food Hydrocolloids, 2016, 60:59-66.

[17] MARTIN G J O, WILLIAMS R P W, DUNSTAN D E. Comparison of casein micelles in raw and reconstituted skim milk [J]. Journal of Dairy Science, 2007, 90(10):4 543-4 551.

[18] BARBARA F, STEFAN H, HELMAR S. Dispersion of powders in liquids in a stirred vessel [J]. Chemical Engineering and Processing, 1999, 38(4-6):525-532.

Effect of decalcification pretreatment on the solubility of milk protein concentrate

LIU Da-song, YU Yun, LI Jun-ke, XU Yu-ting, WANG Miao*, ZHOU Peng

(School of Food Science and Technology, State Key Laboratory of Food Science and Technology, Collaborative Innovation Center of Food Safety and Quality Control, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

A series of milk protein concentrate (MPC) with 0%, 11%, 19%, 27% and 37% of decalcification were prepared by ultrafiltered-diafiltered-ion exchange-drying methods. Decalcified MPC was stored at 35 ℃ for 4 months. The changes in soluble proteins, microstructure and particle size distribution of reconstituted decalcified MPC were determined using sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, confocal laser scanning microscopy and static light scattering, respectively. All freshly prepared MPC maintained the solubility above 95%, and only a slightly increased with the increasing in decalcification. During storage, the solubility of MPC without decalcification decreased sharply and the solubility of MPC with 11% decalcification decreased less, while the solubility of MPC with 19%-37% decalcification remained almost unchanged. The decrease in solubility of MPC was mainly attributed to the aggregation of caseins. The dispersion of MPC also increased with the increasing decalcification. The result showed the solubility and stability of MPC were well maintained at and above 19% of decalcification.

milk protein concentration; decalcification; solubility; particle size distribution

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705014

博士(王淼教授为通讯作者，E-mail: mwang@jiangnan.edu.cn)。

国家自然科学基金(31471697)；教育部科学技术研究项目(113032A)

2016-09-08，改回日期：2016-10-08