荒漠昆虫小胸鳖甲抗冻蛋白MpAFP698对酿酒酵母的低温保护作用

张凤娟，孙琳洁，李素丽，马纪

(新疆大学 生命科学与技术学院，新疆生物资源基因工程重点实验室，新疆 乌鲁木齐, 830046)

荒漠昆虫小胸鳖甲抗冻蛋白MpAFP698对酿酒酵母的低温保护作用

张凤娟，孙琳洁，李素丽，马纪*

(新疆大学 生命科学与技术学院，新疆生物资源基因工程重点实验室，新疆 乌鲁木齐, 830046)

昆虫抗冻蛋白作为天然无毒副作用的低温和冷冻保护剂，在发酵菌种的保藏方面具有很好应用前景。为了验证荒漠昆虫小胸鳖甲(Microderapunctipennis)抗冻蛋白MpAFP698对酵母菌的抗冻和抗低温保护效果，对MpAFP698抗冻蛋白进行原核表达和纯化，获得了具有活性的融合抗冻蛋白MBP-MpAFP698。将质量浓度为1、10、30 μg/mL的MBP-MpAFP698添加到酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，在-7和-20 ℃冷冻处理酵母菌液不同时间；以10 μg/mL的抗冻蛋白在4、0、-50 ℃处理酵母菌液，在-20 ℃反复冻融处理，观察菌落形态并统计菌种存活率。结果表明，添加抗冻蛋白组的酵母存活率显著优于未加抗冻蛋白的对照组，1 μg/mL就有保护效果，10 μg/mL保护效果最好，说明昆虫抗冻蛋白能以极低的浓度发挥低温保护作用。

荒漠昆虫抗冻蛋白；酿酒酵母；抗冻保护；细胞存活

抗冻蛋白(antifreeze protein，AFP)是变温生物为适应严酷的寒冷环境而产生的。抗冻蛋白能够降低溶液的冰点但不改变其熔点，从而产生熔点与冰点之间的温度差值，这个差值叫做热滞活性(thermal hysteresis activity，THA)，其大小用于指示抗冻蛋白的活性[1-2]。AFP的主要功能包括抑制冰晶生长[3-4]、改变冰晶形态和抑制重结晶[5]，并且对细胞膜也有保护作用[6-11]。不同生物的抗冻蛋白活性差异巨大，其中昆虫抗冻蛋白的热滞活性最高[12]。

抗冻蛋白在细胞、精液、胚胎和卵巢组织的低温保存中的研究[13-16]显示出良好的应用前景。2005年刘忠渊等发现，赤翅甲抗冻蛋白能够提高细菌的耐寒能力[17]。2015年Hak Jun Kim发现，一种北极酵母的抗冻蛋白LeIBP可以提高低温储藏细胞的活性，缓解重结晶所造成的低温损伤[18]。抗冻蛋白可以改变冷冻发酵面团的质地和烘焙面包的口感[19]，其主要机制是在低温下保护了面团中的酵母菌。

利用昆虫抗冻蛋白作为低温保护剂，无毒副作用，并且昆虫抗冻蛋白由于活性高，使用浓度微量，保存的菌种无需去除保护剂的特殊处理，对食品生产和加工尤其有利。我们利用新疆荒漠昆虫小胸鳖甲抗冻蛋白MpAFP698进行酿酒酵母的低温保护研究，该蛋白已经被证明具有很好的热滞活性和抗冻保护功能[20]。研究的目的是找出MpAFP698在不同低温下的保护效果，以及最低有效浓度和有效保护时间。实验用抗冻蛋白MBP-MpAFP698是通过重组质粒pMAL-p2X-Mpafp698在大肠杆菌表达系统诱导表达和纯化的融合蛋白，其中MBP是麦芽糖结合蛋白。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

大肠杆菌BL21为本实验室保存，重组质粒pMAL-p2X-Mpafp698为本实验室前期构建保存。酿酒酵母(S.cerevisiae)由新疆大学生命科学与技术学院微生物教研室提供。

1.1.2 主要试剂

Amylose Resin购自Biolabs 公司；低分子量标准蛋白Marker、诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)购自北京经科公司；蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)、溶菌酶(lysozyme)、Triton X-100和所有层析介质均为Amersham Pharmacia Biotech公司产品；配制Column Buffer(20 mmol/L的Ttis-HCl, 200 mmol/L的NaCl,1 mmol/L的EDTA)所需的试剂和其余常用试剂为国产分析纯试剂。

1.1.3 培养基

LB培养基：1%蛋白胨，0·5%酵母浸出粉，0.5%氯化钠，高压灭菌20 min。

YEPD培养基：2%蛋白胨，1%酵母浸出粉，2%葡萄糖。

1.2 方法

1.2.1 小胸鳖甲抗冻蛋白的重组表达、纯化及活性鉴定

挑取转化有重组表达质粒pMAL-p2X-Mpafp698的单菌落，在LB培养基中37 ℃过夜培养，二次接菌培养至OD600=0.5，加入终浓度为0.5 μmol/L的IPTG，诱导表达融合表达蛋白MBP-MpAFP698。其中，MBP是麦牙糖结合蛋白。经SDS-PAGE检测到目的蛋白后，采用直链淀粉树脂(amylose resin)亲和层析法纯化蛋白。采用Bradford法对纯化的蛋白进行定量分析。使用纳升渗透压仪(OSMOMAT 030)观察在MBP-MpAFP698存在的情况下冰晶的形态。

1.2.2 MBP-MpAFP698处理酵母的生长曲线与形态观察

将10 μg/mL的MBP-MpAFP698蛋白加入二次活化的200 μL酿酒酵母菌液中，以不加MBP-MpAFP698的酿酒酵母作为对照，27 ℃振荡培养，每隔8 h检测OD600的吸光值，测到36 h后制作酿酒酵母生长曲线。在培养12、24 h时分别取出菌液通过100×高倍镜观察细胞形态。

1.2.3 MBP-MpAFP698对酿酒酵母的低温保护作用分析

取新鲜制备的酵母一级菌液按1%接种于YEPD培养基中，菌液培养至OD600=1.0。用无菌双蒸水稀释菌液1O-5倍，分别加入终质量浓度为1、10、30 μg/mL的MBP-MpAFP698和30 μg/mL对照蛋白MBP，分别置于-7和-20 ℃下冻存。每隔24 h取出冻存管，融化后吸取100 μL在直径9 cm的YEPD平板上均匀涂布，每组3个重复，28 ℃倒置培养24 h，进行菌落计数。选取10 μg/mL的MBP-MpAFP698检测在-50、0和4 ℃时其对酵母菌的保护作用，通过菌落计数测得酿酒酵母的存活率。

反复冻融处理：在酿酒酵母中添加10 μg/mL的抗冻蛋白，将菌液置于-20 ℃，每隔10 d取出100 μL涂板后，菌液放回-20 ℃继续冷冻，反复冻融50 d。一次性冻融处理：将加入10 μg/mL 抗冻蛋白的菌液混匀，平均分装成若干等份，每隔10 d取1份涂板，实验进行50 d。进行菌落计数，分别观察反复冻融和不经反复冻融的菌液最长保存时间。

利用统计学软件SPSS19.0进行分析数据，统计方法为双因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 小胸鳖甲抗冻蛋白MBP-MPAFP698的原核表达与纯化

将重组质粒pMAL-p2X-Mpafp698转化大肠杆菌BL21，在37 ℃，经0.5 mmol/L IPTG诱导培养4 h后，收集菌体进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。结果表明MBP-MpAFP698蛋白在上清和沉淀中均有表达(图1A)，其中MBP为麦芽糖结合蛋白融合标签，其分子质量约为43 kDa，MpAFP698蛋白分子量约为11 kDa。在约为54 kDa处出现1条特异的条带，其大小与预期相符，说明MBP-MpAFP698已在大肠杆菌中得到表达。纯化后的抗冻蛋白在SDS-PAGE电泳图上显示为单一条带(图1B)。使用纳升渗透压仪观察MBP-MpAFP698对冰晶形态的影响(图1C)，结果显示，抗冻蛋白溶液的冰晶近似棱形，对照PBS缓冲液的近似圆形，说明MBP-MpAFP698抗冻蛋白具有改变冰晶形态的活性。

2.2 MBP-MpAFP698对酿酒酵母生长的影响

在利用抗冻蛋白进行酿酒酵母低温保护实验之前，需要先评估抗冻蛋白作为防冻剂是否影响酿酒酵母的生长。培养液中加入10 μg/mL抗冻蛋白的实验组和不加抗冻蛋白的对照组酵母生长曲线显示，2条生长曲线几乎重合(图2A)，表明抗冻蛋白对酵母在常温条件下的培养与对照组无差异，即对酵母生长无影响。在培养12 h和24 h后，在高倍显微镜下观察细胞形态，2组之间没有显示差异(图2B)。

图2 在酿酒酵母菌液中添加或不添加抗冻蛋白培养12 h和24 h后的酵母形态Fig.2 Morphology of S. cerevisiae after culturing for 12 h and 24 h with or without MBP-MpAFP698

2.3 不同浓度MBP-MpAFP698对酿酒酵母在-7 ℃和-20 ℃的保护作用

将不同浓度的MBP-MpAFP698作为抗冻保护剂添加到酵母菌液中，置于-7 ℃和-20 ℃冻存处理，每天涂板进行菌落计数，计算细胞存活率(图3)。结果表明，在-7 ℃处理2 d时，实验组的平均存活率为85%，而对照组约40%。在处理的第4天，实验组的存活率平均为40%，对照组仅为5%(图3A)。在-20 ℃处理2 d时，实验组的平均存活率为60%，而对照组为30%。在处理的第4天，实验组的存活率平均为25%，对照组为0(图3B)。表明MBP-MpAFP698对酿酒酵母在-7和-20 ℃都有显著的保护效果(在-7 ℃，F3,21=6.3，P<0.05；在-20 ℃，F3,21=7.253，P<0.05)。实验结果也显示，随着在低温下处理时间的延长，各组之间也有显著差异(在-7 ℃，F7,21=27.187，P<0.05；在-20 ℃，F7,21=68.793，P<0.05)。比较不同浓度MBP-MpAFP698的保护效果，从图3A和图3B可以看出，10 μg/mL的保护效果好于其他浓度，从而确定最佳保护浓度为10 μg/mL。实验结果也显示，浓度为1 μg/mL时MBP-MpAFP698也有显著的保护效果，说明荒漠昆虫抗冻蛋白具有极高的活性。

图3 不同浓度MBP-MpAFP698对酿酒酵母在-7 ℃(A)和-20 ℃(B)的抗冻保护效果Fig.3 Antifreeze protective effect of MBP-MpAFP698 at different concentrations on S. cerevisiae at -7 ℃(A) and -20 ℃(B)

2.4 MBP-MpAFP698对酿酒酵母在-50、0和4 ℃保存的影响

选取浓度为10 μg/mL的抗冻蛋白检测其在-50 ℃时的保护效果(图4A)。结果表明，处理第2天实验组存活率为60%，经过反复冻融保存期长达7天以上，而对照组第2天存活率约为30%，在第4天存活率接近0。实验组与对照组存活率差异显著(F1,7=11.811,P<0.05)，表明10 μg/mL MBP-MpAFP698抗冻蛋白在-50 ℃对酵母仍有显著的保护效果。处理组和对照组平板培养的菌落生长结果显示，抗冻蛋白组的菌落数显著多于对照组(图4B)。

A- -50 ℃时对酵母存活率的统计;B-在处理第1、2、3天时菌落生长观察，每个培养皿上标注1表示添加10 μg/mL MBP-MpAFP698，标注2是添加10 μg/mL MBP对照蛋白图4 10 μg/mL MBP-MpAFP698在-50 ℃对酿酒酵母的抗冻保护效果Fig.4 Antifreeze protective effect of MBP-MpAFP698 at 10 μg/mL on S. cerevisiae at -50 ℃

为了检验MBP-MpAFP698在0 ℃以上是否对酵母菌也有保护作用，将添加抗冻蛋白和对照蛋白MBP的菌液分别置于0 ℃和4 ℃处理，每隔5天涂板培养，进行菌落计数(图5)。结果显示，随着处理时间的延长，存活率逐渐下降，实验组与对照组显著差异(在0 ℃,F1,5=12.349,P<0.01; 在4 ℃,F1,5=7.993,P<0.01)。可以看出在0 ℃和4 ℃抗冻蛋白MBP-MpAFP698对酵母的保护效果显著。

图5 10 μg/mL MBP-MpAFP698抗冻蛋白在4 ℃和0 ℃对酿酒酵母的低温保护效果Fig.5 Low temperature protective effect of MBP-MpAFP698 at 10 μg/mL on S. cerevisiae at 4 ℃ and 0 ℃

2.5 MBP-MpAFP698在-20 ℃抗重结晶保护作用

分别以常用抗冻保护剂甘油和MBP蛋白作为对照，以10 μg/mL MBP-MpAFP698作为处理组，在-20 ℃进行反复冻融和一次冻融处理，分析MBP-MpAFP698抗重结晶的效果。结果表明，在两种处理条件下，抗冻蛋白的保护效果均高于对照组甘油和MBP蛋白。其中一次冻融组抗冻蛋白和甘油的保护效果都分别好于反复冻融组。处理20 d时，一次性冻融处理中抗冻蛋白组的存活率是78%，甘油组是40%；在反复冻融处理中，抗冻蛋白组的存活率是50%，甘油组是30%(图6)。在2种条件下，MBP-MpAFP698的保护效果都显著高于甘油及对照蛋白(F3,15=11.84,P<0.01)，表明抗冻蛋白的抗重结晶保护效果显著，存活天数在50 d以上。

图6 MBP-MpAFP698对酵母菌在-20 ℃反复冻融的保护效果Fig.6 Protective effect of MBP-MpAFP698 on S. cerevisiae at -20 ℃ with repeated freeze-thaw

3 讨论

目前抗冻蛋白的应用多处于实验室研究阶段，不能够获得充足有活性的抗冻蛋白可能是主要原因，而以原材料提取抗冻蛋白的方法成本极大。利用基因工程方法为昆虫抗冻蛋白的应用提供了可能。本研究采用大肠杆菌原核表达体系，及Amylose Resin亲和层析纯化获得了较纯的融合抗冻蛋白MBP-MpAFP698，通过纳升渗透压仪观察抗冻蛋白的冰晶形态，冰晶呈细棱状，结果与抗冻蛋白的冰晶形态效应一致[21], 说明重组表达的MBP-MpAFP698蛋白具有较高活性。

抗冻蛋白作为抗冻保护剂，不但效果好而且无毒性[22]，我们对酵母生长曲线的研究表明小胸鳖甲抗冻蛋白对酵母生长无不良影响。抗冻蛋白作为昆虫的天然抗冻保护剂，无毒无害，可作为一种新型食品添加剂，为今后抗冻蛋白作为防冻剂在菌种保存中的应用奠定了一定基础。

研究不同质量浓度MBP-MpAFP698(1、10、30 μg/mL)在-20 ℃和-7 ℃对酿酒酵母的冻存保护效果表明，不同浓度的抗冻蛋白对酵母菌都有较好的保护效果，当浓度为10 μg/mL时保护效果最佳，这说明抗冻蛋白的保护作用和浓度没有线性关系，这与REGAND的研究结果相类似[23]。我们前期研究结果显示MBP-MpAFP698蛋白可以显著地改善冷冻小鼠肝脏等器官的细胞形态，并且在酵母中诱导表达的MpAFP698蛋白和外源添加的MpAFP698蛋白对酵母菌在-7 ℃和-20 ℃有较好的低温保护效果[24-25]。QADDER等人用赤翅甲抗冻蛋白(DAFPs)研究其对牛精液的耐冻性和生育能力时使用的蛋白浓度也为10 μg/mL[26]，并且效果显著，而使用鱼类typeⅢAFP对小鼠卵巢组织进行低温储藏时，Jung Ryeol Lee等人发现蛋白浓度为20 mg/mL时卵泡的凋亡率与对照组相比差异显著[27]，与这些低温保护剂相比，昆虫抗冻蛋白在较低的10 μg/mL就有较高的低温保护效果，提示昆虫抗冻蛋白的热滞活性是鱼类抗冻蛋白的数千倍，虽然由于实验条件不同，不宜简单比较，但确实表明昆虫抗冻蛋白的超高活性[28～30]。在此基础上，选取浓度10 μg/mL分别在4和0 ℃进行菌种保存实验，结果表明在短时间内实验组与对照组差异显著，长期0 ℃和4 ℃低温，对细胞会造成寒害，此时抗冻蛋白发挥保护作用。我们之前研究表明小胸鳖甲抗冻蛋白可降低小鼠血细胞在4 ℃的溶血率[24]，表明其还具有非结冰的低温保护作用。

在证明抗冻蛋白具有酵母抗冻保护作用的基础上，我们进一步探讨了其在-20 ℃对酵母的抗重结晶保护效果。反复冻融是细胞冻存中经常面临的问题，与常规低温保护剂甘油相比，小胸鳖甲昆虫抗冻蛋白MBP-MpAFP698显示了很高的抗重结晶保护作用。文献报道，植物抗冻蛋白主要具有抗重结晶活性，而昆虫抗冻蛋白主要具有很高热滞活性[28-30]，本文首次证明，昆虫抗冻蛋白也具有极强的抗重结晶活性，这对抗冻蛋白的应用具有重要意义。

通过低温冷藏实验发现小胸鳖甲昆虫抗冻蛋白MBP-MpAFP698的浓度在10 μg/mL就对酵母菌有较好的低温保护作用，在4、0、-7、-20和-50 ℃都具有显著的保护效果，并且抗冻蛋白作为冷冻添加剂对细胞的生长的没有影响，而反复冻融实验也证明昆虫抗冻蛋白具有极强的抗重结晶活性。研究结果为开发新一代低温保护剂提供了理论基础。

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Cryoprotective effect of antifreeze protein MpAFP698 from the desertinsectMicroderapunctipennison yeastSaccharomycescerevisiae

ZHANG Feng-juan, SUN Lin-jie, LI Su-li, MA Ji*

(Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering,College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046，China)

Antifreeze proteins as non-toxic cryoprotective agents have extensive prospect in fermentation strain preservation. To test the cryoprotective effect of antifreeze protein MpAFP698 from the desert beetleMicroderapunctipennisonS.cerevisiae, antifreeze protein MpAFP698 was prokaryotic expressed and purified. Fusion protein MBP-MpAFP698 with high activity was obtained. 1, 10, 30 μg/mL of MBP-MpAFP698 were added toS.cerevisiaeand then treated at -7 and -20 ℃ for different time lengths; in other experiments yeast cells were treated at 4, 0, -50 ℃ for different time lengths with 10 μg/mL MpAFP698 as well as repeated freeze-thaw at -20 ℃. The morphology and survival rate of the yeast cells after these treatments were observed or calculated. The results showed that the survival rate ofS.cerevisiaewith the protection of MBP-MpAFP698 were significantly better than the control group without MBP-MpAFP698. Even the concentration of 1g/mL showed protective effect, and 10g/mL showed the best protective effect, indicating that insect antifreeze protein can function as cyroprotective agent at very low concentrations. This result lay a foundation for the development of efficient protective agent at low temperatures.

desert insect antifreeze protein;Saccharomycescerevisiae; antifreeze protection; cell survival

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705007

硕士研究生(马纪教授为通讯作者，E-majiuci@xju.edu.cn)。

国家自然科学基金(31360527)

2016-11-21,改回日期：2017-01-05