疏肝消脂Ⅲ方胶囊对非酒精性脂肪肝大鼠CYP2E1基因表达的影响

陈 进，冯崇廉，聂钊源，邓 炜，李伟杰

（广州医科大学附属第三医院中医科，广州 510150）

疏肝消脂Ⅲ方胶囊对非酒精性脂肪肝大鼠CYP2E1基因表达的影响

陈 进，冯崇廉*，聂钊源，邓 炜，李伟杰

（广州医科大学附属第三医院中医科，广州 510150）

目的 探讨疏肝消脂Ⅲ方胶囊对非酒精性脂肪肝（NAFLD）大鼠的防治作用及对肝组织细胞色素P4502E1mRNA表达的影响。方法 用高脂乳剂灌胃建立NAFLD大鼠模型，于灌胃第6周末形成脂肪肝后，给予疏肝消脂Ⅲ方胶囊和水飞蓟宾胶囊4周，在光镜下观察各组肝脏病理变化，并通过荧光定量(qPCR)法测定大鼠肝组织CYP2E1的mRNA的表达情况。结果 与模型组相比，各药物组肝脏病理变化改善；疏肝消脂Ⅲ方组CYP2E1的mRNA水平较模型组降低（P ＜0.05）。结论 疏肝消脂Ⅲ方胶囊能明显改善高脂饮食大鼠脂肪肝病理学变化，抑制NAFLD氧化应激反应，保护肝脏，作用机制可能与CYP2E1表达有关。

疏肝消脂Ⅲ方胶囊；非酒精性脂肪肝； 细胞色素P4502E1

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是一种遗传—环境—代谢应激相关性疾病，其发病机制尚未完全明确，其中氧化应激对于NAFLD的发生发展起着关键作用。NAFLD通常与代谢紊乱（如肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病和血脂异常等）密切相关，目前现代医学并没有专门针对脂肪肝的药物，对于NAFLD的治疗仅限治疗相关的代谢综合征及预防致病因素，如适量运动、合理饮食、药物（如胰岛素增敏剂、调脂药、保肝剂）等综合治疗[1-2]。疏肝消脂Ⅲ方胶囊是冯崇廉主任近20年应用中药治疗脂肪肝的临床经验方，原方疏肝消脂汤在临床上治疗脂肪肝疗效显著[3]。疏肝消脂Ⅲ方胶囊由原方疏肝消脂汤及后来的疏肝消脂Ⅰ方、疏肝消脂Ⅱ方不断改进，经现代制药工艺加工而成。周大林等[4]研究表明疏肝消脂胶囊可以显著降低NAFLD大鼠肝组织细胞色素P450-2El（CYP2E1）。本研究通过实时荧光定量PCR（PCR）观察疏肝消脂Ⅲ方胶囊对NAFLD大鼠肝组织的CYP2E1mRNA表达的影响，从抗氧化角度进一步深入揭示疏肝消脂Ⅲ方胶囊治疗NAFLD的部分作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 46只SPF级雄性SD大鼠，体质量180～220 g，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2013-0002。

1.2 试剂与设备 高脂乳剂（主要组成：200 mL猪油、100 g胆固醇、10 g丙硫氧嘧啶、10 g蛋黄粉、20 g胆酸钠、200 m L吐温- 80、200 m L丙二醇、300 g果糖、蒸馏水等）由广东省医学实验动物中心配制；Trizol试剂盒：Invitrogen Life Technologies公司产品；FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)：Roche公司产品；PCR引物由Invitrogen Biotechnology Co.LTD公司合成；台式高速冷冻离心机Neofuge 15R：Heal Force公司产品；Step One Plus荧光定量PCR仪：ABI公司产品；MUVB-20凝胶分析系统：美国 Ultra-lum 公司产品。

1.3 药物 疏肝消脂Ⅲ方胶囊，由牛黄田七散合四逆散组方加减而成，每粒胶囊含原生药量约3.12 g。由广州医科大学第三附属医院中医科委托广东新峰药业协制。水飞蓟宾胶囊，购于天津天士力圣特制药有限公司，每粒含水飞蓟宾35 mg。

1.4 模型的建立及分组 46只SD大鼠正常喂养1周后，随机分成正常组10只和非酒精性脂肪肝组36只。非酒精性脂肪肝组36只再随机分模型组,水飞蓟宾胶囊对照组及疏肝消脂Ⅲ方胶囊观察组,每组各12只。正常组（n=10）普通饲料喂养；非酒精性脂肪肝组按1 m L/100 g 体质量灌服高脂乳剂。实验动物自由饮水进食，分笼饲养于（20±2）℃、明暗各12 h的动物实验室内。在6周时，将高脂乳剂灌胃的3组实验大鼠各抽取2只（共6只）处死行肝组织病理学观察，病理切片显示大部分肝细胞肿胀，形态排列不规则，胞浆内充满大小不等的脂滴，表明NAFLD模型建立成功。实验第7周起开始对实验大鼠灌胃给药。正常组和模型组按1 m L/100 g 体质量生理盐水灌胃，1次/d；治疗组予疏肝消脂Ⅲ方胶囊溶液灌胃，1次/d。大鼠灌胃药量按照1 mL/100 g 体质量折算。

1.5 标本采集 药物治疗4周后（即实验第10周末），观察大鼠精神状态、皮毛光泽度、活动情况，称取体质量，然后采取颈椎脱臼法处死大鼠，迅速剖腹，观察肝脏外形、色泽、质地，称取全肝湿重并记录，取相同部位肝组织，按常规制备肝匀浆、肝组织石蜡切片标本，肝组织于-80 ℃冰箱保存，用于qPCR检测。

1.6 病理学检测 取大小相等、部位相同的肝右叶组织放入4%甲醛中固定，石蜡切片，HE染色，光镜下观察各大鼠肝脏脂肪病变及炎症表现。

1.7 Q-PCR检测大鼠肝组织CYP2E1的mRNA表达水平 1）总RNA提取 按Trizol试剂盒常规一步法提取肝脏总RNA。2）反转录取一PCR管，加入含2 μg RNA的溶液和1 μL oligo(dT)15；用无核糖核酸酶的去离子水补足至12 μL；再放于PCR仪上70 ℃保温5 m in后迅速置冰上冷却；依次加入4 μL 5×buffer，2 μL10 mmol/L dNTPs，1 μL RNA inhibitor和1 μL 反转录酶，用枪抽吸混匀；于PCR仪上42 ℃保温60 m in，结束后80 ℃保温5 min灭活反转录酶。3）定量PCR首先取出0.2 m L PCR管，配制反应体系：12.5 μL 2× qPCR M ix、2.0 μL 7.5 μmol/L基因引物、2.5 μL反转录产物、8.0 μL ddH 20，每个反转录产物配制3管；重复上一操作，将目标基因引物换成内参基因引物；将上述反应体系于95 ℃预变性10 m in，然后按下述条件循环40次，变性95 ℃ 30 s、退火60 ℃ 1 m in、延伸72 ℃5 min；溶解曲线75～90 ℃，每20 s升温1 ℃。实验中荧光本底信号和阈值均采用仪器中设置的默认数值，由每次PCR反应结束后系统自动生成，每个PCR反应管内的荧光信号强度达到设定阈值（即基线荧光信号的10倍）时所处的循环数定义为Ct值；待测基因每个模板做3个复孔，分别测得取平均值，△CT=CT目的基因-Ctcyp2e1，△△CT=△CT实验-△CT对照，目的基因的相对表达水平用2-△△CT计算得出。引物序列见表1。

表1 大鼠CYP2E1、GAPDH引物合成基因序列

1.8 统计学分析 采用SPSS 13. 0统计软件处理，实验数据以均数±标准差 (x±s) 表示，多组样本均数比较进行方差齐性检验，组间比较运用单因素方差分析(ANOVA)。方差齐者的两两比较采用LSD法，方差不齐者则采用Dunnet’s T3检验。P ＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 肝脏病理学变化 光镜下HE染色显示，正常对照组大鼠肝组织无脂滴和炎症细胞浸润，而模型组及各药物组所有动物肝组织均出现不同程度的肝细胞脂肪变性，肝细胞体积变大，胞浆内可见脂滴空泡，小叶内可见炎症细胞浸润，模型组脂肪肝程度最重，各药物组脂肪肝程度较模型组明显减轻。

2.2 大鼠肝组织匀浆CYP2E1的mRNA的表达 见表2。

表2 大鼠肝组织匀浆CYP2E1的mRNA的表达

表2 大鼠肝组织匀浆CYP2E1的mRNA的表达

注：与正常组比较，# P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

组 别剂量/(mg/kg)CYP2E1的相对值正常对照组 －1.00±0.18模型组 －2.68±0.26#水飞蓟宾组44.1 1.55±0.22#△Ⅲ方胶囊组315 1.39±0.29#△

3 讨论

NAFLD是一种最常见的肝脏疾病，近年我国代谢综合征、肥胖人数逐渐增多，NAFLD发病率也明显升高[5-6]。目前认为脂肪肝的危害不仅仅是肝硬化的发生，同时也增加心脑血管事件发生的比例[7]。因此，NAFLD越来越受到广泛重视。对于NAFLD的确切发病机制尚不十分清楚，近年提出肠道微生态失衡可能与NASH的发生发展有关[8]，但是医学界广泛接受的非酒精性脂肪肝的发病机制是Day等[9]提出的“二次打击”学说。在NAFLD的“二次打击学说”中，“首次打击”是胰岛素抵抗影响脂质代谢，导致肝细胞内脂肪酸储积；“第二次打击”则是在胰岛素抵抗的基础上，肝细胞中大量游离脂肪酸的聚集使线粒体内β氧化反应率增加，并引起CYP2E1的水平升高，导致活性氧的增加，这一系列氧化应激的改变即为NAFLD发病的“第二次打击”[10]。而细胞色素氧化酶P450-2El亚型(CYP2E1)是参与氧化应激和脂质过氧化过程中的关键酶[11]。细胞色素P450酶是微粒体混合功能氧化酶系中最重要的一族氧化酶，主要存在于肝细胞微粒体中，是参与药物代谢与失活以及身体其他外来物质代谢作用重要的酶，其中CYP2El作为细胞色素P450超家族(CYP450)重要成员之一，参与乙醇、四氯化碳、丙酮、苯等药物、毒素、前致癌物质代谢活化及不饱和脂肪酸氧化，在非酒精性脂肪肝的发病中起到重要作用[12-13]。CYP2E1主要分布在肝脏，约占肝脏CYP总量的7%，在一些肝外组织(如脑、肺、胃、肠、心脏等)也有高表达[14]。研究[11]表明，CYP2E1的表达与非酒精性脂肪肝的易感因素：肥胖、2型糖尿病及高脂血症等密切相关。在非酒精性脂肪肝中CYP2E1蛋白被自然地诱导，随着脂肪肝程度的加重，肝细胞结构和功能的损害，脂质过氧化反应加剧，CYP2El表达明显增高[15]。CYP2E1的高表达使线粒体、微粒体氧化反应异常增强，发生生物膜脂质过氧化，并减弱抗氧化系统的保护作用，引起肝细胞损害[16]。CYP2E1与肝毒性物质如脂多糖、花生四烯酸等有协同肝毒性作用，促进肝细胞的凋亡、坏死[17]。本实验研究提示模型组大鼠较空白对照组存在明显的脂肪肝变性、坏死，且CYP2E1mRNA表达量明显增加（P＜0.05），说明CYP2E1活性增强在非酒精性脂肪肝发病中起作用。

冯崇廉教授认为：肝脏异常堆积的脂肪为黄白有形之物，类似于中医痰凝，痰阻气机，气机不利；肝郁气滞，气滞则血瘀，痰瘀互为因果。认为肝郁气滞、痰瘀互结乃脂肪肝病机的关键所在[18]。疏肝消脂Ⅲ方胶囊根据“肝主疏泄”理论，针对肝郁气滞、痰瘀互结的病机关键，以疏肝解郁，祛瘀化痰为主要治则。疏肝消脂Ⅲ号方主要以四逆散合牛黄田七散加味而成，方中以四逆散加郁金、素馨花疏肝行气解郁，丹参、山楂活血祛瘀消脂；泽泻、萆薢利湿去浊；溪黄草利湿退黄；荷叶升清降浊；白花蛇舌草清热凉肝解毒，而牛黄、三七对降解肝内血脂堆积有良好疗效；诸药合伍共奏疏肝利气，清脂降脂，降解肝内脂肪堆积之功。从本实验的结果笔者观察到，与模型组相比，疏肝消脂Ⅲ方胶囊能够明显改善脂肪肝大鼠肝脏病理表现，且能抑制cyp2e1基因的表达；与水飞蓟宾胶囊药物组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。根据本次实验结果可以推断，以疏肝解郁，祛瘀化痰为主要治则能够切中非酒精性脂肪肝的病机关键，疏肝消脂Ⅲ方胶囊对NAFLD大鼠具有防治作用，其疗效与水飞蓟宾胶囊相当，其作用机制之一是抑制肝细胞中CYP2E1基因的表达,从而减轻氧应激和脂质过氧化反应。本研究为临床预防和治疗NAFLD 提供了新的思路。

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Effect ofS hugan Xiaozhi decoction IIIcapsule on the CYP2E1 in the rat w ith non-alcoholic fatty liver disease

CHEN Jin, FENG Chonglian*, NIE Zhaoyuan, DENG Wei, LI Weijie
(The Third A ffi liated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, China)

Objective To study the therapeutic effects of Shugan Xiaozhi decoction III capsule on the expression of hepatic cytochrome P4502E1mRNA in the rats w ith non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).Methods The animal model of non-alcoholic fatty liver disease w ith high fat emulsion, and rats were treated w ith Shugan Xiaozhi decoction III capsule or Silibinin capsules for four weeks after fatty liver in rats was developed by irrigation at 6th week. To observe the pathological changes in the liver of each group under the light m icroscope, and the rat liver CYP2E1 mRNA expression were determ ined by fl uorescence quantitative PCR (qPCR) method.Results Comparing w ithmodel group, the levels of the pathological changes in the liver were decreased in all medicine groups. The mRNA expressions of CYP2E1 in Shugan Xiaozhi decoction III capsule group were lower than those in model group (P<0.05). Conclusion Shugan Xiaozhi Decoction III capsule can signifi cantly improve pathology, oxidative stress reaction and protect the liver, which may related w ith the expression of CYP2E1 in NAFLD.

Shugan Xiaozhi decoction III capsule; nonalcoholic fatty liver; cytochrome P4502E1

R285.5

A

2095-6258（2017）03-0351-04

2016-05-18）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.03.003

广州市“十二五”重点中医肝病专科（穗卫中[2013] 6号）；广州市中医药科技项目（穗卫中[2014] 3号；20142A011005）。

陈 进（1990 -），女，硕士研究生，主要从事中医内科学方向研究。

*通信作者：冯崇廉，男，主任医师，硕士研究生导师，电话-18928916692, 电子信箱-fengchonlian@126.com