电项针对失眠大鼠脑干单胺类神经递质含量的影响

吴建丽，王天琪，王永亮，杜冬梅，史文强，王 薇*

（1．黑龙江中医药大学针灸研究所，哈尔滨 150040；2．黑龙江中医药大学附属第二医院， 哈尔滨 150001）

电项针对失眠大鼠脑干单胺类神经递质含量的影响

吴建丽1，王天琪1，王永亮2，杜冬梅1，史文强2，王 薇1*

（1．黑龙江中医药大学针灸研究所，哈尔滨 150040；2．黑龙江中医药大学附属第二医院， 哈尔滨 150001）

目的 通过观察不同刺激频率电项针对PCPA致失眠大鼠脑干内单胺类神经递质5-羟色胺（5-HT）、多巴胺（DA）和去甲肾上腺素（NE）含量的影响，初步探讨电项针促眠的作用机制及不同刺激频率电项针的疗效差异。方法 将Wistar大鼠50只随机分成5组，即正常组，模型组，电项针1组（取刺激频率2 Hz）、电项针2组（取刺激频率50 Hz）、电项针3组（取刺激频率100 Hz）。除正常组外，各组采用腹腔注射对氯苯丙氨酸（PCPA）制备大鼠失眠模型。造模成功后，电项针各组分别按各自刺激频率给予干预治疗，1次/d，30 min/次，连续7 d，治疗后留取脑干组织检测单胺类神经递质5-HT、DA、NE的含量变化。结果 模型组大鼠脑干组织中5-HT含量明显低于正常组，DA、NE含量高于正常组，差异具有统计学意义（P ＜0.05）；经电项针治疗7 d后，失眠大鼠脑干5-HT含量升高，DA、NE含量显著降低，与模型组比较差异有统计学意义（P ＜0.05）；电项针各组之间疗效比较，电项针1组明显优于电项针2和电项针3组（P ＜0.05）；电项针2和电项针3组比较无统计学意义（P＞0.05）。结论 电项针改善失眠的作用机制可能与调节失眠大鼠脑干内单胺类神经递质5-HT、DA、NE的质量浓度有关；电项针2组疗效优于其他2组，说明2 Hz刺激频率电项针治疗失眠效果更好。

失眠；电项针；脑干；单胺类神经递质

随着人们工作和生活节奏加快，失眠的发病率不断升高。据统计[1]，我国普通人群中有45.4%的人存在睡眠问题，其中失眠比例高达28.0%，失眠已经严重困扰了人们的正常生活，甚至会导致心理疾病和意外伤害等。西医治疗失眠主要应用镇静催眠药物和抗抑郁药等，但存在成瘾性和依赖性等毒副反应，长期应用还会损伤认知功能[2]。针灸治疗失眠有见效快、作用稳定、多靶性治疗、简单易行、无毒副作用等优点[3-4]。电项针疗法[5]是高维滨教授采用传统针灸学理论与现代神经解剖学相结合而创立的治疗脑部神经系统疾病的新方法，临床应用治疗失眠疾病效果显著，但是其作用机理尚未被明确揭示。现代研究表明脑干内的单胺类神经递质与睡眠和觉醒状态密切相关，故本实验通过观察失眠大鼠治疗前后对脑干内5-HT、DA和NE含量的影响，初步探究电项针治疗失眠的疗效及作用机制，同时评价不同频率电项针间的疗效差异，为临床上应用电项针治疗失眠并采用效果最佳的刺激频率提供一定治疗依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级健康雄性Wistar大鼠50只，体质量220～250 g，9周龄，由哈尔滨医科大学实验动物学部提供，实验动物生产许可证号：SCXK（黑）2013-001。实验大鼠自由进食饲料和水，室内饲养温度为（23±1）℃，湿度维持在45%～65%。

1.1.2 动物分组 大鼠适应性饲养1周后，将50只大鼠随机数字表法分为5组，即正常组，模型组，电项针1组（取刺激频率2 Hz）、电项针2组（取刺激频率50 Hz）、电项针3组（取刺激频率100 Hz）。每组各10只，用苦味酸染色标记编号。

1.1.3 仪器与试剂 6805-AⅡ型电针仪（汕头市医用设备厂有限公司）；一次性无菌针灸针（北京中研太和医疗器械有限公司）；Allegra 64R台式高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）；梅特勒XS105型精密分析天平（瑞士产）；HHS21-6电热恒温水浴锅（上海跃进医疗器械厂）；VERSA max酶标仪（购自美国Molecular Devices公司）；PCPA（美国Sigma公司）；大鼠5-HT、DA、NE ELISA测定试剂盒（南京建成生物研究所）。

1.2 方法

1.2.1 建立失眠动物模型 根据肖成荣等[6]文献报道，本实验采用PCPA法制备大鼠失眠模型。将PCPA按30 mg/mL溶于弱碱性生理盐水（pH 7.0～8.0），并用超声波振荡器促进药物溶解，配置后药物呈乳白色混悬液。除正常组外，其余各组连续2 d于每日上午9:00腹腔注射PCPA，剂量为10 mL/kg，1次/d。大鼠于第1次注射28～30 h后，有以下表现表示造模成功：昼伏夜行节律消失，白天活动不停，对周围声音、光刺激敏感，兴奋性增高，容易嘶叫打斗，饮食和二便明显增多，整体观察与正常组明显不同。

1.2.2 干预治疗 造模成功后，每日将大鼠四肢和躯体固定，选用双侧的“风池”和“供血”穴，常规消毒，取0.25 mm×25 mm无菌针灸针向对侧鼻尖方向刺入，深度约7 mm，将电针连于针柄，同一根线上下连接，同时各治疗组选用相应的刺激频率：电项针1组刺激频率为2 Hz、电项针2组刺激频率为50 Hz、电项针3组刺激频率为100 Hz。刺激强度以大鼠出现头部震动，但使不剧烈挣扎嘶叫为度，1次/d，30 min/次，连续治疗7 d。正常组和模型组大鼠每日以相同方式抓取固定30 min，不做其他处置。

1.2.3 取材 治疗7 d后，所有大鼠采用颈椎脱臼法处死，用剪刀从正中将头皮剪开剥离，从耳孔处插入向另一侧耳孔剪开颅骨，再用骨钳分开颅骨，在冰盒上迅速分离出脑干，用冰冷生理盐水冲洗，且用滤纸吸干水分，分别称重后放入标记好的EP管内。迅速冰冻于液氮中1 m in，放入-80 ℃保存备用。测定时，将脑干组织在冰浴条件下加入按重量1∶9加入冷生理盐水，用玻璃匀浆器手动匀浆、离心沉淀（4 ℃，6 000 r/min，15 min），取上清液待用。

1.2.4 指标检测 应用ELISA方法在VERSA max酶标仪上测定脑干组织内5-HT、DA、NE的含量，严格按照试剂盒说明书操作，结果用ng/L单位表示。

1.2.5 统计学方法 所用数据采用SPSS 16.0软件进行分析和描述，计量资料以均数±标准差（x±s）表示。实验数据先进行正态性检验，符合正态分布，且组间方差齐性的比较采用单因素方差分析（ANOVA），不满足此条件的数据采用非参数检验，以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般活动及体征观察 所有大鼠在适应性饲养期内昼夜节律正常，精神状态良好，饮食和二便正常。在连续2 d腹腔注射PCPA混悬液后，睡眠—觉醒周期消失，说明造模成功。表现为大鼠白天睡眠减少，精神萎靡，攻击性强，易激惹。经过电项针治疗后大鼠的睡眠周期逐渐恢复，白天活动减少，不易惊醒，闭目倦卧时间增多，其中电项针1组大鼠失眠状态改善最为明显。

2.2 失眠大鼠脑干内5-HT、DA、NE含量比较 见表1。

表1 大鼠脑干组织内5-HT、DA、NE含量比较（x±s，n=10） ng/L

3 讨论

5-HT能神经元主要位于脑干中缝核，研究[7-10]发现，破坏中缝核或向脑内注射神经毒素，可以阻断5-HT的合成导致动物出现完全性失眠，而在失眠期间注射5-HT睡眠将恢复正常，因此，5-HT被认为是脑内的“致眠因子”。脑桥蓝斑核是NE能神经元最密集的地方，研究发现，损毁蓝斑核尾部时NE含量明显下降，快波睡眠被完全抑制，而损毁头部则对快波睡眠无影响；同时还发现，蓝斑核受损后，脑电图上快波显著减少，出现睡眠样慢波，但此时动物在行为上仍可行走，可见NE与脑电觉醒和快波睡眠的产生密切相关。DA在中脑黑质系统主要传递兴奋性作用，但实验[11]表明，破坏中脑DA系统后，动物脑电图上出现觉醒的快波，行为上却不能表现为觉醒，可知行为觉醒与DA水平有关。总之，这3种神经递质大多存在于脑干离散部位，通过作用脑干区域的突触活动而共同调节睡眠—觉醒周期。

风池、供血穴是电项针治疗失眠的主穴，两穴的解剖结构下就是与睡眠密切相关的部位：脑干。脉冲电流通过风池、供血穴经过脊髓后角到达脑干，通过脑干上行网状激活系统增加大脑皮质的兴奋性，恢复大脑皮层兴奋与抑制的平衡，改善失眠状态[12]。同时二穴位于颈部椎-基底动脉附近，针刺后可以扩张脑部血管，增加脑血流量[13]，改善脑干细胞代谢，使脑干网状结构的功能恢复正常，调整睡眠－觉醒周期。

本实验结果显示，模型组大鼠脑干组织中5-HT含量明显低于正常组，DA和NE含量高于正常组（P ＜0.05），表明造模影响了脑干内5-HT、DA及NE的含量水平，这3种物质的含量异常是导致大鼠失眠的原因之一。与模型组相比，经过3种不同频率的电项针治疗后，5-HT水平均上升，DA及NE均下降（P ＜0.05）。表明应用电项针治疗后能调节脑干内单胺类递质含量水平，加深慢波睡眠量，促进睡眠发生，恢复睡眠周期节律。

本实验还发现刺激频率为2 Hz的疗效优于50 Hz和100 Hz，这可能是频率快慢与其产生的补泻作用有关，一般认为，＜3 Hz的低频具有兴奋作用，可“补虚”，而＞50 Hz的高频具有解痉镇痛的作用，可“泻实”，二者之间的频率具有平补平泻的作用。失眠的主要病机为卫强营弱，阳不入阴，其治疗原则为补虚泻实，结合现代医学，治疗失眠的关键在于恢复大脑兴奋与抑制的平衡。本方法的机理是白天运用低频脉冲电流刺激项部的风池和供血穴，通过脑干网状上行激活系统增强大脑皮层的兴奋性，发挥低频“补”的作用，恢复兴奋与抑制之间的平衡。

综上所述，电项针治疗失眠的机理与增加脑干单胺类递质5-HT含量，降低DA及NE含量有关，且低频刺激的效果更优。

参考文献：

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Research of electro-nape-acupuncture on the contents of monoam ine neurotransm itters in brainstem of insomnia rats

WU Jianli1, WANG Tianqi1, WANG Yongliang2, DU Dongmei1, SHI Wenqiang2, WANG Wei1*
(1. Research Institute of Acupuncture and Meridians of Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China；2. The Second Affi liated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150001, China)

Objective To observe the effect of different frequencies of electro-nape-acupuncture (ENA) on the contents of monoam ine neurotransm itters 5-hydroxytryptam ine (5-HT), dopam in (DA) and norepinephrine (NE) in brainstem of insomnia rats induced by PCPA, to discuss primarily the mechanism of promoting sleep and therapeutic effi cacy of different frequencies of ENA. Methods Fifty Wistar rats were random ly divided into fi ve groups, those are normal group, model group, ENA groupⅠ(stimulus frequency of 2 Hz), ENA groupⅡ(stimulus frequency of 50 Hz) and ENA group Ⅲ (stimulus frequency of 100 Hz). The animal models of insomnia were established by parachlorophenylalanine (PCPA) intraperitoneal injection in each group except normal group. After duplicating the modelssuccessfully, each ENA group rats were treated by ENA therapy at different stimulus frequencies respectively for seven consecutive days, 1 time/day, 30m in/time. After treatment the brainstems were taken and measured the contents of neurotransmitters 5-HT, DA and NE.Results The content of 5-HT were significantly lower and the contents of DA and NE were higher in the animal model of rats than that in the normal group, there were statistically signifi cant differences (P <0.05); A fter the seven days of ENA treatment, the 5-HT content increased and the DA and NE contents decreased in brainstems of insomnia rats. Compared w ith the model group, there were signifi cant differences (P<0.05). Among the ENA groups, ENA groupⅠwas greatly superior to ENA groupⅡand ENA group Ⅲ at regulating the levels of monoam ine neurotransm itters (P<0.05), however, there were no statistically signifi cant difference between ENA group Ⅱand ENA group Ⅲ (P >0.05).Conclusion The mechanism of ENA improve the structure of sleep may involve the regulation of monoam ine neurotransm itters 5-HT, DA and NE contents in brainstem of insomnia rats．

insomnia; electro-nape-acupuncture; brainstem; monoam ine neurotransm itter

R749.7

A

2095-6258（2017）03-0358-04

2016-10-12）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.03.005

哈尔滨市科技局科技创新人才研究专项资金“基于电项针对睡眠剥夺大鼠促眠作用的机制研究”（2015RAQXJ093）。

吴建丽（1986 -），女，硕士研究生，助理研究员，主要从事针灸治疗睡眠障碍性疾病研究。

*通信作者：王 薇，电话-13796190978，电子信箱-1533236349@qq.com