双参通冠方对心肌梗死模型大鼠VEGF表达和炎性因子的影响

王永刚，李彩红，于远望，钟 伟，齐 婧，尚俊平

（1.陕西中医药大学心脑血管病研究所，陕西 咸阳 712000；2.陕西中医药大学第二 附属医院，陕西 咸阳 712000）

双参通冠方对心肌梗死模型大鼠VEGF表达和炎性因子的影响

王永刚1,2，李彩红1,2，于远望1，钟 伟1,2，齐 婧1,2，尚俊平1,2

（1.陕西中医药大学心脑血管病研究所，陕西 咸阳 712000；2.陕西中医药大学第二 附属医院，陕西 咸阳 712000）

目的 研究双参通冠方对急 性心肌梗死模型大鼠的VEGF表达和炎性因子的影响。方法 SD大鼠分为模型组、空白组、双参通冠低剂量组(2.5 g/kg)、中剂量组(5 g/ kg)、高剂量组(7.5 g/kg)，采用结扎左冠状动脉前降支建立大鼠心肌梗死模型，灌胃给药2周后，取大鼠的心肌组织，Western blot法检测大鼠的心肌组织VEGF蛋白表达，Elisa法检测心肌组织匀浆中IL-1、IL-6、TNF-α、CRP的含量。结果 与空白组比较，模型组大鼠心肌组织中VEGF表达增高，心肌组织匀浆中IL-1、IL-6、TNF-α、CRP的含量增高，差异有统计学意义(P＜0.05）；与模型组比较，双参通冠方低剂量组、中剂量组和高剂量组VEGF表达增多，双参通冠方低剂量组IL-6、TNF-α含量均降低，双参通冠方中剂量和高剂量组IL-1、IL-6、TNF-α、CRP含量均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与双参通冠方中剂量组比较，低剂量组IL-1、IL-6、CRP含量增高和VEGF表达降低，高剂量组TNF-α、CRP含量降低和VEGF表达增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 双参通冠方可减轻大鼠心肌炎性反应，促进血管内皮细胞增殖，诱导缺血部位血管新生，对心肌具有保护作用，可能与增加VEGF的表达和抑制心肌的炎性因子有关。

双参通冠方；心肌梗死；VEGF；炎性因子

《中国心血管病报告2015》指出，心血管病死亡占城乡居民总死亡原因的首位，急性心肌梗死（AM I）病死率总体亦呈现上升态势[1]。近年来，国际大型随机临床试验[2]证实：冠脉血运重建疗法（冠脉介入治疗和冠脉搭桥术）仅能使部分患者获益，且治疗后出现的无复流现象、再狭窄、支架内血栓形成等问题仍欠缺较好的解决办法。国内外大量临床试验[3]所证实，益气活血类的中药复方对冠心病均有一定的治疗效果，能够促使缺血心肌的血管新生和侧支循环形成。本研究拟采用双参通冠方干预心肌梗死大鼠模型，检测心肌组织VEGF的表达和白介素-1（IL-1)、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、C反应蛋白(CRP）的含量，探索其促血管新生和侧枝循环形成的机制。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性SD大鼠，体质量180～220 g，75只。由第四军医大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK-（军）2014-005。实验前大鼠禁食24 h，术前4 h禁饮。

1.2 仪器与试剂 BW-BM 1103小动物呼吸机，上海软隆科技发展有限公司；GS-15R冷冻离心机，美国Bekman公司；Ascent全自动酶标仪，美国Thermo公司；紫外分光光度计，美国Pharmacia公司；DYY-6C电泳仪，北京仪器厂；GDS7600凝胶图像分析仪，英国UVP公司。ELISA试剂盒（IL-1、IL-6、TNF-α、CRP），上海沪尚生物科技有限公司。

1.3 药物 双参通冠方（由丹参、人参、红景天、三七粉、降香等组成，按2:2:1:0. 5:0. 5 的比例配伍，由陕西中医药大学第二附属医院制剂室制备），双参通冠低剂量2.5 g/kg、中剂量5 g/ kg、高剂量7.5 g/ kg（分别相当于生药材的4、8、12 g）。

1.4 方法

1.4.1 分组与给药 75只SD大鼠随机分为空白组、模型组、双参通冠低剂量组、双参通冠中剂量组、双参通冠高剂量组，每组15只。空白组和模型组给予生理盐水，双参通冠低、中、高剂量组分别给予相应浓度的汤药，10 mL/kg灌胃，1次/d，共14 d。

1.4.2 心肌梗死模型制备 大鼠称重，3%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，监测Ⅱ导联心电图，气管插管连接小动物呼吸机，经左前胸3-4肋间开胸，充分暴露心脏，用6-0无创缝线结扎左冠状动脉主干支（在动脉圆锥与左心耳之间距主动脉根部约1 mm处），心电示波器显示Ⅱ导联J点或ST段抬高＞0.2 mV，局部心肌颜色变暗后迅速关胸缝合。术后腹腔注射青霉素40万U，防止感染。

1.5 观察指标 末次给药后2 h处死大鼠，暴露大鼠心脏，剪取左心室经液氮后保存于- 80 ℃的冰箱中保存备检。1）心肌组织匀浆制备：自冰箱取出大鼠心肌组织，解冻后用冰盐水漂洗，取0. 3 g心肌组织，用眼科剪刀剪碎，置于预冷的玻璃匀浆器中，将捣杆垂直充分研磨6～8 min，使组织匀浆化，低温4 000 r/min离心15 min后取上清液，采用Elisa法检测心肌组织中IL-1、IL-6、TNF-α、CRP的含量。2）Western blot法检测VEGF 蛋白表达：分别取各组大鼠心肌组织，裂解沉淀离心去上清，以冷PBS 洗涤2 次，加入上样缓冲液，100 ℃ 5 min，取25 μg 蛋白样品经10%SDSPAGE，120 V 80 min 电泳分离总蛋白，以半干式电转仪100 V 80 min 转移蛋白至PVDF 膜。膜用含5%脱脂奶的PBST 室温孵育1 h 后，加入羊抗大鼠多克隆VEGF 一抗稀释度为1: 300，β-actin一抗，4 ℃杂交过夜。次日洗膜3 次，每次15 min，加入兔抗羊IgG 二抗，室温孵育1 h，TBS漂洗，应用ECL 试剂盒行发光反应，图像扫描分析。

1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析，组间比较有显著差异进一步行q检验进行两两比较，若方差不齐采用秩和检验。

2 结果

2.1 大鼠的一般状况 造模组大鼠可见精神萎靡，毛色枯槁，嗜卧少动，畏冷蜷缩，食量减少，伴腹泻、稀便，体质量减轻等。给予双参通冠方药后，上述症状部分好转。空白组大鼠活泼好动，皮毛光亮，体质量增加。造模与给药期间，模型组大鼠死亡5只，双参通冠方低剂量和中剂量组各死亡3只，双参通冠方高剂量组大鼠死亡1只。其原因为结扎冠状动脉后出现严重的心律失常死亡。舍弃其他组多余大鼠，各组均取10只。

2.2 对心梗模型大鼠心肌组织匀浆IL-1、IL-6、TNF-α、CRP含量的影响 见表1。

表1 双参通冠方对心梗模型大鼠心肌组织匀浆IL-1、IL-6、TNF-α、CRP含量的影响（x±s，n=10） ng/L

2.3 对心梗模型大鼠心肌组织VEGF表达的影响 与空白组比较，模型组大鼠心肌组织VEGF表达增高，差异有统计学意义 （P ＜0.05）；与模型组比较，双参通冠方低剂量组、中剂量组和高剂量组VEGF表达均升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与双参通冠方中剂量组比较，低剂量组VEGF表达降低，高剂量组VEGF表达升高，差异具有统计学意义（P ＜0.05）。

3 结论

心肌梗死属于中医“真心痛”的范畴，其病因多因寒凝气滞、血瘀痰浊阻络，心脉突然闭阻，气血运行中断而引发。其病位在心，主要病机为本虚标实,而在急性期则尤以标实为主。陈可冀院士认为主要病机为“血脉瘀滞、心脉不通”，倡导以活血化瘀法作为基本治法[4]。路志正认为病机为胸中阳气虚衰, 邪侵阳位, 气机痹阻。卫气虚弱，寒邪痹遏胸阳；营气不足，心失荣养；营卫失常可引起宗气不利而致疼痛。故治疗以调和阴阳、调理脾胃、畅通气血, 使营卫和谐、宗气旺盛、胸阳振奋、血脉贯通, 胸痹自愈[5]。

双参通冠方由丹参、人参、红景天、三七粉、降香等组成，具有益气活血、通络止痛的功效。现代药理学研究[6-9]表明：丹酚酸A能有效抑制心肌缺血及心肌梗死引起的血清肌酸磷酸激酶活性升高以及乳酸脱氢酶的释放，减少心肌耗氧量，可调节血脂水平并保护游离脂肪酸导致的内皮细胞损伤，明显改善冠脉血流量、心肌缺血程度及心肌缺血范围，减轻心肌梗死。人参皂甙Rg1刺激心肌局部组织分泌G-CSF 而诱导骨髓细胞游走至局部缺 血组织, 进而发挥其高度自我复制和多分化能力向血管内皮细胞分化，促进缺血心肌组织的毛细血管再生及血流供应的维护。人参总皂苷可上调心肌组织VEGF和bFGF 基因表达、促进血管新生而增加血液供应，增加梗死区域及其周边CD31阳性微血管密度，促进侧支循环的建 立，缩小心肌梗死面积，减轻梗死区心肌纤维化，抑制心室重构。红景天苷通过上调VEGF 的表达而促大鼠心肌梗死后心肌组织的血管新生。

研究[10-11]还表明，血管新生受各种因子的影响，促血管新生因子可降解细胞外基质，增加血管壁的通透性，促进内皮细胞的增殖。VEGF 在新生血管形成的过程中发挥着重要的作用，VEGF 与其受体结合后促进内皮细胞的分化、增殖和迁移，是血管新生和心肌侧枝循环形成的重要信号通路蛋白。本实验研究结果表明，双参通冠方可通过改善大鼠心肌的炎性反应和VEGF的表达，促进缺血心肌微血管新生和侧枝循环的形成，减轻心肌梗死的程度。

参考文献：

[1]陈伟伟, 高润霖, 刘力生, 等. 《中国心血管病报告2015》概要[J]. 中国循环杂志, 2016,31(6): 521-528.

[2]PATEL MR, DEHMER G J, HIRSHFELD J W, et al. ACCF/ SCAI/STS/AATS/AHA/ASNC 2009 appropriateness criteria for coronary revascularization[J].J Am Coll Cardiol, 2009,53(6): 530-553.

[3]王永刚, 齐婧, 郑刚, 等. 双参通冠胶囊对急性心肌梗死直接PCI术后的临床观察[J]. 中国中西医结合杂志, 2012, 32(12): 1602-1606.

[4]马世玉, 张敏. 通冠胶囊防治冠心病和急性心肌梗死研究进展[J]. 时珍国医国药, 2015, 26(6): 1449-1451.

[5]郑丽, 刘红旭. 当代名老中医治疗急性心肌梗死经验总结[J]. 北京中医,2007,26(4):221-223.

[6]李磊, 任建勋, 林治荣, 等. 丹酚酸A不同给药途径对犬急性心肌缺血影响[J]. 中国中药杂志, 2016,41(5):910-916. [7]王宁元, 吕传江, 陈学海, 等. 人参皂甙Rg1诱导骨髓干细胞游走分化促进家兔心肌梗死后心肌血管内皮细胞再生的研究[J]. 中国中西医结合杂志,2005,25(10):916-919.

[8]魏英, 余丽梅, 王钰莹, 等. 人参总皂苷促进血管新生改善急性心肌梗死大鼠心功能[J]. 中国药理学通报,2016, 32(4):559-563,564.

[9]杨雷, 刘暖, 毛秉豫, 等. 红景天苷上调大鼠心肌梗死后心肌组织VEGF的表达[J]. 南阳理工学院学报,2013,5(6): 120-124.

[10]YAMAZAKI YASUO, MATSUNAGA YUKIKO, TOKUNAGA Yuko, et al. Snake venom Vascular Endothelial Grow th Factors (VEGF-Fs) exclusively vary their structures and functions among species[J]. J Biol Chem, 2009,284(15):9885-9891.

[11]付卫云, 刘暖, 杨雷, 等. 红景天苷促大鼠心肌梗死后心肌组织血管新生的作用[J]. 中药药理与临床,2015,31(5): 30-33.

Effects ofS huangshen Tongguandecoction on infl ammatory factor and VEGF expression in rats model w ith myocardial infarction

WANG Yonggang1,2, LI Caihong1,2, YU Yuanwang1, ZHONG Wei1,2, QI Jing1,2, SHANG Junping1,2
(1.Cardio-Cerebrovascular Diseases Institute, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712000, Shaanxi Province, China;
2.The Second Affi liated Hospital, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712000, Shaanxi Province, China)

Objective To study the effects of Shuangshen Tongguan decoction on infl ammatory factor and VEGF expression in rats model w ith myocardial infarction. Methods SD rats were divided into model group, blank group, Shuangshen Tongguan decoction low dose group (2.5 g/kg), m iddle dose group (5 g/kg) and high dose group (7.5 g/kg). Myocardial infarction model was established by ligation of left anterior descending coronary artery. A ftertwo weeks of intragastric adm inistration, the myocardial tissue of rats was taken. Western blot method was used to detect the expression of VEGF protein in myocardial tissue of rats, and the content of IL-1, IL-6, TNF-α, CRP were detected by Elisa.Results Compared w ith the blank group, the VEGF expression of model group in rat myocardial tissue was increased, IL-6, IL-1, TNF -α and CRP content in the myocardial tissue homogenate was increased, the difference was statistically signifi cant (P<0.05); Compared w ith model group, the VEGF expression of Shuangshen Tongguan decoction low dose group, m iddle dose group and high dose group was increased, IL-6 and TNF-α content of Shuangshen Tongguan decoction low dose group was decreased, IL-1, IL-6, TNF-α and CRP levels of Shuangshen Tongguan decoction m iddle and high dose group were decreased, the difference was statistically signifi cant (P<0.05); Compared w ith Shuangshen Tongguan decoction m iddle dose group, IL-1, IL-6 and CRP level of slow dose group was increased and the VEGF expression was reduced, TNF-α and CRP of the high dose group were decreased while the VEGF expression was increased, the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion Shuangshen Tongguan decoction could reduce myocardial inflammatory reaction of rats, promote vascular endothelial cell proliferation, induce ischem ia parts of angiogenesis and protect myocardial. This may be related to increased expression of VEGF and inhibition of infl ammatory factor in myocardium.

Shuangshen Tongguan decoction; myocardial infarction; VEGF; infl ammatory factor

R285.5

A

2095-6258（2017）03-0348-04

2016-08-05）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.03.002

陕西省科技厅自然科学研究计划项目（2015JM 8384）;陕西省中医药管理局中医药科研项目（15-SCJH017）;陕西省第五批重点专科心脑血管病科建设项目；国家中医药管理局重点专科心血管病科建设项目。

王永刚（1977 -），男，副教授，副主任医师，主要从事中医药干预心脑血管疾病的基础与临床研究。