针康法对脑缺血大鼠脑组织微血管内皮超微结构及aFGF、PF4蛋白表达影响*

陈慧杰，唐 强△，朱路文，叶 涛 ，李 季 ，颜培宇，王 艳

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001;2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

针康法对脑缺血大鼠脑组织微血管内皮超微结构及aFGF、PF4蛋白表达影响*

陈慧杰1，唐 强1△，朱路文1，叶 涛2，李 季1，颜培宇2，王 艳1

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001;2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：探讨针康法对脑缺血后脑组织微血管内皮超微结构及酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、血小板第4因子(PF4)蛋白表达影响。方法：180只大鼠随机分为模型组、针刺组、康复组、针康组及假手术组。参照Longa线栓法制备永久的局灶性脑缺血模型。模型组和假手术组不给予任何干预，针刺组应用头穴丛刺针法，康复组应用跑台训练，针康组应用头穴丛刺结合跑台训练。电镜观察各时间点各组大鼠缺血半暗区皮层微血管内皮的超微结构，Western Blot 法检测各时间点各组大鼠缺血半暗区皮层aFGF及PF4蛋白表达。结果：微血管内皮超微结构:术后3天，针刺组、康复组及针康组可见整个管腔内充满内皮细胞，管周水肿程度减轻，但针康组的效果较好;术后7天时，针康组内皮细胞增殖明显，微血管内膜平整，管腔无狭窄,而针刺组和康复组微血管内膜较针康组欠平整，微血管管腔狭窄;术后14天时，针康组微血管基膜是完整的，且内皮细胞基本恢复正常,而针刺组及康复组微血管基膜稍显不完整。aFGF及PF4蛋白表达：术后各时间点，较模型组比较，各干预组aFGF蛋白表达明显升高(均P<0.05)，PF4蛋白均明显降低(均P<0.05)；术后7天、14天，较针刺组、康复组比较，针康组aFGF蛋白表达升高(均P<0.05)，PF4蛋白表达降低(均P<0.05)。结论：针康法通过上调缺血脑组织aFGF，下调PF4蛋白表达，降低缺血脑组织血管内皮的损伤。

脑缺血；针康法；酸性成纤维细胞生长因子；血小板第4因子；血管新生

脑缺血后大脑组织缺血、缺氧，局限性脑组织坏死或脑软化，破坏了神经血管单元的稳态，最终导致神经功能缺损。脑缺血后神经血管单元的重构是促进脑功能重塑的重要环节。血管新生能够协调优化神经血管单元各组分，为其重构提供必要的神经血管底物。此过程受血管再生正、负性调节性质血管因子调控。酸性成纤维细胞生长因子(Acidic fibroblast growth factor，aFGF)为正性调节血管因子，血小板第4因子(Plateletfactor-4，PF4)为负性调节血管因子，二者在血管新生中起重要作用[1-2]。本研究探讨针康法对脑缺血大鼠脑组织微血管内皮超微结构及aFGF与PF4蛋白表达影响，探讨针康法降低脑缺血后神经功能障碍的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

清洁级雄性大鼠(Sprague-Dawley系)，初始体质量250～280 g，鼠龄10～12周，由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供,合格证书编号SYXK(黑)2010007。SPF 级实验中心饲养，温度要求23℃～25℃，湿度保持在50%～60%，12 h明暗人工光照循环。实验前3天进行适应性跑台训练(15 m/min，30 min/天)，筛选可完成跑台训练的大鼠180只。实验过程中大鼠的处理严格遵守动物伦理准则和指南的相关条例。

将180只大鼠顺序编号，计算机生成一个含180个数的随机数字表，任意选择表中一个数为起始点对应大鼠编号1，从左至右，自上而下分别对应1～180号大鼠。确定各编号的组别的方法是用表中随机数字除以5得余数，余数0、1、2、3、4分别对应假手术组、模型组、针刺组、康复组及针康组，最终各组随机分入36只大鼠，依照此法，将各组的36只大鼠随机分入3天、7天、14天3个亚组中(n=12)。实验过程中剔除造模失败或死亡的大鼠，并继续造模补充以保证最终进行电镜及Western Blot检测时均有6只大鼠。

1.2 实验试剂与仪器

试剂：aFGF 、PF4多克隆抗体(SANTA CRUZ)，羊抗兔IgG-HRP(BEYOTIME),β-actin抗体(WANLEIBIO)，TEMED(AMRESCO),PVDF膜(MILLIPORE)，预染蛋白分子量标准(FERMENTAS)。

仪器：一次性无菌针灸针(华佗牌)，Hettich Mikro 220冷冻离心机(HETTICH)，Multiskan FC型酶标仪(THERMO)，Smart Simplicity型超纯水系统(MERCK)，DYY-7C 型电泳仪电源、DYCZ-24DN型蛋白凝胶电泳仪、DYCZ-40D 型转印电泳仪、WD-9405B 型脱色摇床、WD-9413B型凝胶成像分析系统(北京六一),ZH-PT型动物实验跑台(徐州利华)。

1.3 永久性脑缺血模型制备

1.3.1 造模方法 参考Longa法[3]及前期实验研究[4]，通过阻闭大鼠大脑中动脉(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)，造成永久的局灶性脑缺血。术前12 h停止供食不限水。用10%水合氯醛按0.35 ml/100 g体重标准腹腔注射麻醉大鼠，术中动物保持自主呼吸。颈部备皮，常规消毒后在颈正中切口，暴露大鼠的颈总、颈外及颈内动脉，先结扎颈总、颈外动脉，再用微动脉夹夹闭颈总动脉分叉处血流，在其下方3～5 mm处剪一“V”型小口，将头端过蜡的鱼线送入血管，备活结以固定线栓，随后松开动脉夹将鱼线送入颈内动脉入颅，阻断右侧大脑中动脉血流供应。将活结扎死以固定线栓，消毒，缝合。假手术组大鼠不插入线栓，其余操作同模型组。

1.3.2 成模标准 术后24 h采用Longa标准[3]进行筛选，1～3分的MCAO大鼠纳入本实验。评分标准如下：① 0分:正常，无神经功能缺损表现；② 1分:提尾时偏瘫侧前肢屈曲；③ 2分:平地行走时向偏瘫侧转圈；④ 3分:向偏瘫侧转圈伴倾倒；⑤ 4分:意识障碍，不能自主行走。

1.4 各组干预方法

假手术组及模型组：术后回笼饲养，不进行任何治疗，只给予同等条件抓取。

针刺组：术后24 h，采用头穴丛刺针法治疗。参照前期实验研究[4]，采用0.25 mm×25 mm针灸针，取百会穴及其左、右两侧各旁开2 mm处的3个位置进行针刺，由前向后刺入15 mm后快速捻转1 min，留针2 h，每日1次。

康复组：术后24 h，采用循序渐进的跑台训练治疗，方案如下：坡度：0°；速度：1～3天8 m/min,4～7天12 m/min,7天后15 m/min；时间：30 min/次。每日1次。

1.2.5 严格控制碘的摄入量 对于甲状腺功能亢进患者来说，如果摄入碘过量会导致其临床症状加重，不仅如此，碘摄入还会对采取131I治疗患者的疗效产生抑制作用。因此，护理人员要严格控制患者的碘摄入量，并指导患者掌握碘含量较高食物的识别方法，并介绍常见的碘含量较高的食物，如海带、海鱼、海虾、海白菜、甘蓝、海藻、卷白菜、昆布、大头菜等。

针康组：术后24 h，采用针康法治疗，即让大鼠头穴丛刺留针期间完成跑台训练，每日1次。头穴丛刺方案同针刺组，跑台训练方案同康复组。

1.5 电镜检测

术后3天、7天、14天，各组大鼠干预结束后，用10%水合氯醛按0.5 ml/100 g体重深度麻醉，依次心内灌注0.9%生理盐水和4%多聚甲醛各200 ml。对梗死周边皮层缺血组织进行定位，取1 mm×1 mm×1 mm组织块置于3%戊二醛缓冲液和1%锇酸后固定各1 h。脱水结束后，渗透包埋处理，半薄切片，转移至光镜下再定位，超薄切片，再分别入3%枸橼酸铅与0.1%醋酸钠进行双重染色。透射电镜观察内皮细胞形态及细胞内部超微结构的改变。

1.6 Western Blot检测

术后3天、7天、14天，各组大鼠干预结束后，深度麻醉大鼠，置于冰面上快速断头取脑，分离大脑中动脉梗死周边皮层缺血组织，放入5 ml冷冻管中，液氮中速冻5 min后置于-80℃冰箱中冻存备用。

取一定量标本，加入细胞裂解液处理后制成蛋白匀浆，经低温孵育后提取上清液。BCA法测定上清液中蛋白质的总浓度，本实验上样体积20 μl，含50 μg蛋白。用10% SDS-PAGE电泳分离目的蛋白(80 V,2.5 h), 然后将已分离的区带电转移到PVDF膜上(70 V,1.5 h)。置于TTBS缓冲液配制的5%脱脂奶粉封闭液内室温封闭1 h后，将膜放入已稀释好的aFGF(1∶200)、PF4(1∶400)中，4℃过夜孵育。一抗孵育结束后，加入羊抗兔IgG-HRP二抗 (1∶5 000稀释)，室温孵育1 h，TBST洗膜，之后加入ECL发光孵育5 min，显影，凝胶成像仪上照相记录后保存，用Gel-Pro Analyzer 4.0对图中反应条带进行相应的定量分析。各组aFGF、PF4蛋白表达量记为aFGF、PF4与β-actin的灰度值比。

1.7 统计学分析

2 结果

各时间点，假手术组大鼠大脑皮层微血管丰富，排列紧密，管腔大小正常，内皮细胞光滑无肿胀，基质膜完整。术后3天，模型组血管周围水肿严重，组织间隙增大，出现微血管内皮细胞增殖现象，同一视野下可见两个内皮细胞核；与针刺组、康复组比较，针康组可见整个管腔内充满内皮细胞，管周水肿程度减轻。术后7天，模型组缺血侧皮层微血管内皮细胞体积增大，基质膜排列不齐，管周水肿程度加重；针康组内皮细胞增殖明显，微血管内膜平整，管腔无狭窄，而针刺组和康复组微血管内膜较针康组欠平整，微血管管腔狭窄。术后14天，模型组缺血侧皮层微血管内皮细胞胞质回缩，基膜厚度增加，膜色加深，内皮细胞凋亡，血管腔狭窄明显或闭塞，管周仍有少量水肿；针康组缺血侧大脑皮层微血管基膜已基本完整，内皮细胞相对恢复正常；与针康组相比，针刺组、康复组微血管基膜稍呈不完整。具体见图1。

图1 各组大鼠脑组织微血管内皮的超微结构注：A：假手术组；B：模型组；C：针刺组；D：康复组；E：针康组;a:术后3天(6000×)；b：术后7天(20500×)；c：术后14天(11500×)

2.2 各组大鼠脑组织aFGF蛋白的变化

各时间点，以假手术组aFGF蛋白表达情况作为标准参照，模型组aFGF蛋白表达明显增加，差异显著(均P<0.05)，伴随缺血时间延长，aFGF蛋白表达呈现持续上调趋势；与模型组比较，针刺组、康复组及针康组aFGF蛋白表达增加，差异显著(均P<0.05)。术后7天、14天，与针刺组、康复组比较，针康组aFGF蛋白表达增加，差异显著(均P<0.05)。见表1、图2。

表1 各组大鼠不同时间点aFGF蛋白表达水平±s)

注：与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与针刺组比较，cP<0.05；与康复组比较，dP<0.05

2.3 各组大鼠脑组织PF4蛋白的变化

各时间点，以假手术组PF4蛋白表达情况作为标准参照，模型组PF4蛋白表达明显增加，差异显著(均P<0.05)，伴随缺血时间延长，呈现先增后降趋势；与模型组相比，针刺组、康复组及针康组PF4蛋白表达均减少，差异显著(均P<0.05)。术后7天、14天，与针刺组、康复组比较，针康组PF4蛋白表达进一步减少(均P<0.05)。见表2、图3。

表2 各组大鼠不同时间点PF4蛋白表达水平±s)

注：与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与针刺组比较，cP<0.05；与康复组比较，dP<0.05

图2 Western Blot检测aFGF蛋白表达注：A：假手术组；B：模型组；C:针刺组；D:康复组；E:针康组

图3 Western Blot检测PF4蛋白的表达注：A：假手术组；B：模型组；C:针刺组；D:康复组；E:针康组

3 讨论

针康法是脑卒中康复的新策略，是头穴丛刺法与现代康复技术的完美融合，具有“针康同步、动态治疗、整体康复”的特色。围绕脑卒中后患者肌张力异常、平衡障碍、言语及认知障碍等，课题组开展了一系列研究，证实针康法明显改善功能障碍，提高日常生活活动能力，优于单纯头穴丛刺或康复治疗[5-9]。基础研究中，课题组从突触形成和重建、神经细胞再生、细胞凋亡、炎症级联反应等角度[10-14]，阐明了针康法降低脑缺血后神经功能缺损的相关机制，但还有待于进一步研究。

促血管因子及抑制血管因子之间动态平衡的变化影响脑缺血后血管新生。促血管新生因子主要由VEGF及其受体、血管生成素及其受体、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor，FGF)等组成。FGF属于非特异性血管新生促进因子，其成员包含酸性成纤维细胞生长因子 (acidic fibroblast growth factor,aFGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)等，它们既可以通过上调VEGF mRNA表达发挥间接的调节作用，又可直接作用在血管内皮细胞，促进血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成，正性调控血管新生。既往研究显示，脑缺血后1天即可检测到aFGF在缺血半暗区皮层神经元表达，在最初的2周内表达量是不断增加的[15]；而脑缺血后1天神经元也存在bFGF阳性表达，胶质细胞和血管内皮细胞在2周内也会不同程度表达bFGF蛋白[16-17]。脑内注射外源性aFGF可明显促进MCAO大鼠缺血半暗区VEGF表达，使得微血管数量增多，神经功能缺损情况得到改善[1]。

抑制血管生成因子具有抑制血管生成的作用，其作用途径包括内皮细胞增殖、微管形成、内皮细胞迁移及胞外基质重建等[18]。PF4是血小板特异性蛋白、一种内源性血管新生抑制剂,它不仅参与很多人体重要的生理过程，如凝血、炎性趋化、免疫反应及组织修复等，同时还涉及加重血管内膜损伤病理过程[2]。PF4可与VEGF、FGF相互作用，通过竞争性结合血管内皮细胞表面的肝素区域以减弱VEGF、bFGF的结合能力，从而抑制内皮细胞的增殖；且VEGF信号介导的PKC-MAP通路下游的水解酶——磷脂酶C2γ的酪氨酸化可被PF4干扰，导致内皮细胞增生信号减弱[19-20]。另外，PF4可干扰基质金属蛋白酶[21]和整联蛋白[22]所介导的血管内皮细胞黏附及迁移过程，抑制血管新生。

前期研究发现，针康法可增加脑缺血大鼠缺血半暗区VEGF阳性表达，上调bFGF蛋白表达，下调血管抑制素(AS)蛋白表达，改善缺损的神经功能[4,23]。本研究结果显示，针康法可改善缺血后血管内皮损伤，促进内皮细胞增殖。术后各时间点，假手术组aFGF、PF4蛋白基础表达和模型组aFGF、PF4蛋白均有不同程度上调，可能脑缺血后大量微血管缺血坏死，血管新生稳态被打破，相关调控因子基础值上调，与参与血管内皮损伤过程有关；经针刺、康复、针康治疗后，血管新生朝着正性调控方向发展，aFGF蛋白表达进一步上调，PF4蛋白表达有所下调，加速血管内皮损伤的修复。术后7天、14天，与针刺组和康复组比较，针康组的bFGF蛋白明显升高，PF4蛋白明显降低，表明针康法的正性调控作用比单一的针刺、康复训练更强，且这种优势在远期治疗时更加明显。

综上,针康法能够降低脑缺血大鼠缺血脑组织血管内皮的损伤，其机制可能与上调缺血脑组织血管再生促进因子aFGF蛋白表达、下调血管抑制因子PF4蛋白表达、加快血管内皮损伤的修复相关。

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Influence of Acupuncture-Rehabilitation Therapy on MicrovascularEndothelial Ultrastructure,Expression of aFGF andPF4 in Cerebral Ischemia Rats

CHEN Hui-jie1,TANG Qiang1,ZHU Lu-wen1，YE Tao2,LI Ji1,YAN Pei-yu2,WANG Yan1

(1.TheSecondAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Harbin150001，China;2.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Harbin150040，China)

Objective：To investigate the influence of Acupuncture-Rehabilitation Therapy on microvascular endothelial ultrastructure and expression of acidic fibroblast growth factor (aFGF) and platelet factor-4 (PF4) in cerebral ischemia rats. Methods：Permanent focal cerebral ischemia was established in rats according to Longa methods. 180 rats were randomly divided into model group(group M), sham group(group C), acupuncture group(group A), rehabilitation group(group R) and acupuncture combined with rehabilitation group(group A-R). No treatment was given to group M and group C. Cluster needling of scalp acupuncture was given to group A. Treadmill training was used for group R. The combination therapy of acupuncture and treadmill training was used for group A-R. Ultrastructure of microvascular endothelial around penumbral cortex area, facilitated factor aFGF and inhibitory factor PF4 were observed and detected by electron microscopy at each time point by Western Blot method. Results：Microvessel endothelia ultrastructure：3 days after modeling, endotheliocytes were filled in lumen and edema around was relieved in group A, group R and group A-R, of which group A-R was better than the other two groups. 7 days after modeling, the proliferation of endotheliocytes was significant, microvascular endangium was smooth and no stricture developed in lumen in group A-R; Unsmooth microvascular endangium was found in the other two groups. 14 days after modeling, microvascular basement membrane was complete and endotheliocytes returned to almost normal in group A-R; Microvascular basement membrane was a bit incomplete both in group A and group R. Expression of revascularization facilitated factor aFGF and inhibitory factor PF4: At various time points, compared with group M, the expression of aFGF was all higher (P<0.05) and the expression of PF4 was all lower (P<0.05) in the three intervened groups. 7 days and 14 days after modeling, the expression of aFGF in group A-R was obviously higher (P<0.05) and the expression of PF4 protein was obviously lower (P<0.05) than those in group A and group R. Conclusion：Acupuncture-Rehabilitation Theray can reduce the vascular endothelial cell injury, which may be associated with the up-regulation of aFGF protein expression and down-regulation of PF4 protein expression.

Cerebral ischemia;Acupuncture-rehabilitation Therapy;Acidic fibroblast growth factor;Platelet factor-4;Angiogenesis

国家自然科学基金项目,编号：81273818，81473762;黑龙江中医药大学领军人才计划项目，编号：2012RCL02。

陈慧杰(1982-),女，主治医师，从事脑卒中康复工作。

△通讯作者：唐强(1963-),男，教授，博士研究生导师，研究方向：中医康复基础与临床研究。

R246.6

A

1005-0779(2017)05-0065-05

2016-12-07