热性惊厥患儿人类疱疹病毒6型感染的检测分析

孙岩+王锋+于静+马兰红+古丽比亚+余亮+罗新辉+孙荷

摘要：目的 了解热性惊厥患儿人类疱疹病毒6型（HHV-6）的感染情况。方法 采集患儿血清及脑脊液样本，采用间接免疫荧光法检测样本中的HHV-6 IgM、IgG抗体，采用巢氏PCR法检测样本中的HHV-6 DNA。结果 热性惊厥患儿血清HHV-6 IgM阳性率为17.00%（9/53），IgG阳性率为66.00%（35/53）；脑脊液HHV-6 IgM和IgG均未检出阳性。血清样本中，HHV-6 DNA扩增阳性率为18.90%（10/53），其中有7例IgM为阳性，95份脑脊液样本均未扩增出HHV-6 DNA。结论 热性惊厥和HHV-6感染可能有相关性，但本研究仅在部分热性惊厥患儿血清中查出HHV-6 IgM或HHV-6 DNA，脑脊液样本均未查出HHV-6 IgM或HHV-6 DNA，因此本研究未能证实HHV-6的噬神经特点，有待加大样本量进一步深入研究。

关键词：儿童；热性惊厥；疱疹病毒6型

Abstract：Objective To investigate the effects of febrile seizures in children with human herpes simplex virus type 6（HHV-6）infection.Methods Serum and CSF samples were collected and detected by indirect immunofluorescence assay in samples of HHV-6 IgM，IgG antibody，using nested PCR method to detect the samples of HHV-6 DNA.Results the positive rate of serum HHV-6 in children with febrile convulsion（9/53）of IgM was 17.00%， IgG positive rate was 66.00%（35/53）；Cerebrospinal fluid HHV-6 IgM and IgG were not detected positive.The positive rate of HHV-6 DNA amplification was 18.90%（10/53）in serum samples.Among them，IgM was positive in 7 cases and HHV-6 DNA was not amplified in 95 cerebrospinal fluid samples.Conclusion Febrile convulsion and HHV-6 infection may have a correlation，but only part of this study in the serum of children with febrile convulsion was found in HHV-6 IgM or HHV-6 DNA，cerebrospinal fluid samples were not found in HHV-6 IgM or HHV-6 DNA，so this study failed to confirm the neuronophagia characteristics of HHV-6，to add a large sample of further research.

Key words：Children；Febrile convulsion；Herpesvirus 6

1986年Sslahuddin等發现了一种具有疱疹病毒形态和嗜淋巴细胞的新病毒，最初认为该病毒只感染新鲜分离的B淋巴细胞，曾被命名为人嗜B淋巴细胞病毒，后来人们发现它与疱疹病毒科中的其它病毒抗原性和酶切图谱不同，故更名为人疱疹病毒6型（Human herpesvirus-6， HHV-6），此后世界各地又陆续分离出一些毒株，进一步研究发现HHV-6分为两个亚型，即A组（GS株）和B组（Z29株）[1]。HHV-6属于人类疱疹病毒 亚族，这一亚族病毒的细胞感染范围广，致病性尚未完全了解，其感染与临床上许多疾病有关，如幼儿急疹、慢性疲劳综合征等[2]，有研究表明，部分3岁以内患儿伴发热的严重惊厥或拟似脑炎与HHV-6感染相关[3]。本研究通过了解热性惊厥患儿HHV-6感染情况，探讨患儿热性惊厥与HHV-6感染的关系。

1资料与方法

1.1一般资料 2010年9月～2015年3月在新疆维吾尔自治区人民医院儿科就诊的高热惊厥儿童共95例，其中脑脊液和血清标本都有的53例，其它42例仅有脑脊液（未收集到血清），其中男童48例，女童47例；维吾尔族52例，汉族26例，回族8例，哈萨克族9例。纳入标准：年龄为新生儿～14岁，有高热惊厥症状；排除标准：被诊断为结核性脑炎、细菌性脑炎及非感染性脑炎患儿。

1.2方法

1.2.1标本的采集 在发热3 d内采集患儿静脉血3 ml，枸橼酸钠无菌抗凝，分离血清，4℃保存备用；脑脊液标本的收集：留取2 ml以上脑脊液放入无菌试管中，4℃保存备用。

1.2.2实验室检测 采用间接免疫荧光法检测患儿血清及脑脊液中HHV-6 IgM、IgG抗体，间接免疫荧光法检测试剂盒购自欧盟医学诊断（中国）有限公司，将血清或脑脊液用吸附剂按1：10稀释，混匀后，点于载玻片上，37 ℃温育90 min，用PBS洗3次，加入含有伊文斯蓝的荧光素标记抗人IgM或IgG FITC结合物，37℃孵育30 min，用PBS洗3次，用蒸馏水脱去盐分1次。风干后封片，在荧光显微镜下读片，放大倍数400倍，荧光显微镜下细胞膜、胞浆或细胞核可见绿色荧光判为阳性，试剂盒提供阳性及阴性对照做质控。血清和脑脊液的IgM、IgG均按照1：10滴度进行检测。

采用巢氏PCR法检测所有样本中HHV-6 DNA。试剂盒提取血清及CSF中HHV-6 DNA，置-20℃备用，根据HHV-6大衣壳蛋白基因（LTP gene）的DNA序列设计一对外引物和一对内引物，各引物序列，见表1。外（内）引物PCR反应体系为：上游引物10 μmol，下游引物10 μmol，Taq DNA聚合酶 1U，dNTP 20 mmol，Mgcl2 30 mmol，10×PCR Buffer 2.5 μl，模板DNA 2 μl，ddH2O补足至20 μl。外引物、内引物PCR的反应参数均为：94℃预变性5 min；（94℃ 35 s，55℃ 45 s ，72℃ 55s），共35个循环；72℃总延伸8min，取10 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，见表1。

1.2.3统计学方法 采用EXECL2003和SPSS16.0软件进行数据收集和处理。

2结果

2.1间接免疫荧光法 热性惊厥患儿血清HHV-6 IgM阳性率为17.00%（9/53），IgG阳性率为66.00%（35/53）；脑脊液HHV-6 IgM和IgG均未检出阳性。

2.2巢氏PCR法 取10 μl PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，90V 30 min，凝胶成像系统观察电泳条带并拍照，外引物PCR产物片段为287 bp，内引物PCR产物片段为163 bp，见图1。

53例血清中，巢氏PCR阳性10例，阳性率为18.9%，其中8例年龄在1岁以下，10例中有7例的间接免疫荧光法结果为阳性，提示巢氏PCR法敏感性高于间接免疫荧光法。95例脑脊液样本均未扩增出HHV-6 DNA。

3讨论

儿童热性惊厥的发病机制尚不明确，可能与遗传、感染、免疫、发热等有关。首次热性惊厥患儿年龄在2个月～6岁，发病高峰期是1～2岁，呼吸道感染、幼儿急诊、急性中耳炎与热性惊厥的发生有关，孙冬青等报道94.70%的首次热性惊厥患儿患有呼吸道感染或幼儿急疹，首次热性惊厥患儿与HHV-6感染合并率为34.7%[4]，本研究在18.90%的热性惊厥患儿中扩增出了HHV-6 DNA，其中的大部分患儿都<1岁，提示HHV-6感染与热性惊厥的发生相关，如果<1岁的儿童首次发生热性惊厥时，应考虑到HHV-6感染。

国外一些研究也证实HHV-6有噬神经的特点，但大部分热性惊厥患儿只能从血液中查到HHV-6，在脑脊液中很难检出HHV-6 DNA[5]，也有在脑脊液中检出HHV-6 DNA的报道，如Kondo等对仅有一次热性痉挛发作的患儿脑脊液进行检测，HHV-6 DNA都为阴性[6]，但幼儿急疹患病后热性痉挛反复发作3次以上者，脑脊液中HHV-6 DNA检出率很高，据此他推测HHV-6在原发感染后形成潜伏感染，反复的热性惊厥可能与潜伏的HHV-6被激活有关[7]。本研究结果显示，热性惊厥与HHV-6感染有相关性，但仅在部分热性惊厥病例血清中查出HHV-6 IgM抗体或HHV-6 DNA，在滴度为1：10时95例热性惊厥患儿脑脊液IgG抗体均为阴性，且通过巢氏PCR检测所有脑脊液中均未扩增出HHV-6 DNA，因此本研究未能证实HHV-6的噬神经特点，有待加大样本量进一步深入研究。

参考文献：

[1]Joshua A.hill，Nagagopal venna.Human herpesvirus 6 and the nervous system [J].Handbook of Clinical Neurology，2014，123（2）：327-355.

[2]D.A.Clark.Clinical and laboratory features of human herpesvirus 6 chromosomalintegration [J].Clin Microbiol Infect，2016，22：333-339.

[3]Shiho Yamamoto，Satoru Takahashi，Ryosuke Tanaka，et al.Human herpesvirus-6 infection-associated acute encephalopathy without skin rash [J].Brain and Development，2015，37：829-832.

[4]張冬青，孙若鹏.首次热性惊厥与人疱疹病毒6型感染的关系[J].山东大学学报（医学版），2008，46（2）：185-187.

[5]Joshua A.Hill，Michael J.Boeckh，Ruth Hall Sedlak，et al.Human herpesvirus 6 can be detected in cerebrospinaluid without associated symptoms after allogeneic hematopoietic cell transplantation[J].Journal of Clinical Virology，2014，61：289-292.

[6]Kondo K，Nakafuji H，Hata A，et al.Association of HHV-6 infection of the central nervous system with recurrence of febrile convulsions[J].J lnfect Dis，1993，167：1197-1200.

[7]Kondo K，Nakafuji H，Hata A，et al.Prevalence of Chromosomally Integrated Human Herpesvirus 6 in Patients with Human Herpesvirus 6 Central Nervous System Dysfunction[J].Biol Blood Marrow Transplant，2015，21：364-381.

编辑/李桦