不同菌种发酵苹果浓缩汁的风味成分变化分析

王昕悦，曹少军，赵华杰，秦静，武晓丹，胡晓慧，陈荣荣

(恒枫食品科技有限公司，浙江 杭州，311215)

不同菌种发酵苹果浓缩汁的风味成分变化分析

王昕悦，曹少军，赵华杰，秦静，武晓丹，胡晓慧，陈荣荣*

(恒枫食品科技有限公司，浙江 杭州，311215)

利用植物乳杆菌EM1L115、乳酸克鲁维酵母EM1Y071发酵苹果浓缩汁，对比分析发酵前后的挥发性香气成分、游离氨基酸、有机酸等的成分及变化。发现EM1L115发酵苹果浓缩汁风味改变不显著，主要贡献成分为乳酸；EM1Y071单菌以及与EM1L115协同发酵苹果浓缩汁有较明显的风味变化且二者差异性大，主要是发酵代谢生成的酯类、醇类，以及呈味氨基酸和有机酸变化协同改变的结果。

发酵苹果浓缩汁；乳酸克鲁维酵母；植物乳杆菌；香气成分；游离氨基酸；有机酸

苹果浓缩汁具有快速处理易腐果蔬、节省空间成本、便于运输等优点；但因在浓缩过程挥发性风味物质因蒸发而逸散，营养物质也有所损耗，造成其缺乏鲜榨苹果汁的香气、口感和营养成分[1]。从目前市场上看，我国苹果浓缩汁大多只是进行简单的粗加工，缺乏核心竞争力[2]；针对浓缩造成的问题，一般采用香气回填进行改良；在发酵工艺上，主要生产苹果醋和苹果酒，而对于利用发酵改善风味的苹果浓缩汁研究较少。

为此，本研究通过乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)单菌及混菌发酵苹果浓缩汁，利用菌株生长代谢生成的氨基酸类、有机酸类、醇类、酯类等丰富苹果浓缩汁的风味和口感，并分析发酵前后风味成分的变化，以期获得具有不同方向的独特风味、多元化的发酵苹果浓缩汁。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试菌种

植物乳杆菌EM1L115(LactobacillusplantarumEM1L115)、乳酸克鲁维酵母EM1Y071(Kluyveromyceslactis)；均由宏胜饮料集团有限公司食品研发中心保藏提供。

1.1.2 苹果浓缩汁的制备

将脱色苹果浓缩汁(山东佳美食品工业有限公司，70°Brix)用二级水稀释到25°Brix，95 ℃巴氏杀菌10 min，冷却至30 ℃待用。

1.1.3 主要试剂

2-辛醇(2-Octanol)(99%，内标，比利时Acros公司)；乳酸、乙酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸：色谱纯,美国Sigma-Aldrich公司；混合氨基酸标准液,和光纯药工业株式会社；甲醇：色谱纯,西班牙Scharlau公司。

1.2 仪器与设备

Quintix513-1CN型分析天平，赛多利斯科学仪器(北京)；ML1602电子天平，梅特勒托利多；YXQ-LS50SⅡ自动温控高压灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SW-cj-1FD型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；SPX-250B-Z生化培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；Agilent 7890A/5975C型气质联用仪，美国安捷伦公司；L-8900氨基酸自动分析仪，日立集团；Agilent 1260型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司。

1.3 实验方法

1.3.1 发酵苹果浓缩汁的制备

以菌种作为本试验中唯一单因素变量，其余发酵条件一致进行发酵；将EM1L115、EM1Y071单菌以及1∶1混合的菌粉(后文均分别用A、B、C代替)，以0.01%接种量接种于上述处理好的苹果浓缩汁中，以不接种的苹果浓缩汁作为对照，同时在30 ℃下静置培养48 h，发酵完毕后将其在85 ℃灭菌5 min冷却后在12 000 r/min下离心10 min，取上清液经0.22 μm水系滤膜过滤离心获得上清液，测其挥发性香气成分、游离性氨基酸、有机酸含量。

1.3.2 挥发性香气成分的测定

1.3.1.1 预处理条件

采用固相微萃取法(solid-phasemicroextraction,SPME)，样品用量0.5 g，内标2-辛醇0.005～0.008 g，萃取头：DVB/CAR/PDMS，50/30μm；吸附温度50 ℃，吸附时间30 min，解吸时间5 min。

1.3.1.2 气相条件

色谱柱：HP-INNOWAX毛细管色谱柱(30 m×250 μm，0.25 μm)；进样口250 ℃，分流比40∶1，载气流速1.0 mL/min；升温程序：50 ℃保持5 min，以2 ℃/min升至160 ℃，保持5 min，以12 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。

1.3.1.3 质谱条件

离子化能量70 eV；MSD传输线温度280 ℃；离子源温度200 ℃；四级杆温度150 ℃；MS扫描范围m/z30～500。

1.3.3 游离氨基酸的测定

使用日立L-8900氨基酸分析仪，采用GB/T5009.124—2003 食品中氨基酸的测定的方法[3]测定。

1.3.4 有机酸的测定

色谱柱：CAPECELL PAK MG S5 C18柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；进样量20 μL，柱温40 ℃，紫外检测器检测波长210 nm，流动相：用V(0.1%磷酸溶液)∶V(甲醇)=97.5∶2.5的流动相等度洗脱10 min，然后用较短的时间梯度让甲醇相达到100%并平衡5 min，再将流动相调整为V(0.1%磷酸溶液)∶V(甲醇)=97.5∶2.5，平衡5 min。

2 结果与分析

2.1 不同菌种发酵苹果浓缩汁香气成分测定结果及比较

不同菌种在发酵过程中由于菌种代谢产生的代谢产物会对果汁风味有较明显的影响。以苹果酒为例，苹果原料自身固有香气在长时间发酵过程中被分解，而长时间发酵过程中，酵母种类和发酵条件是造成苹果酒风味独特性的主要因素，尤其是高级醇和酯类的种类含量占主导地位[4]。乳酸克鲁维酵母是一种非酿酒酵母属酵母，发酵性能较差，乙醇生成含量低；但合理的利用，可以有效地丰富乳酒或果酒中风味物质[5]。

通过气象色谱与质谱联用分析EM1L115(A)、EM1Y071(B)、二者混合(C)发酵苹果浓缩汁以及未发酵苹果浓缩汁的香气成分，图1是分析所得的相应质谱总离子流色谱图，表1是数据分析结果；其中2-辛醇和2-辛酮是为内标及内标衍生物。从表1可以清楚地看出植物乳杆菌发酵在香气上贡献并不大，除糠醛外均无显著性变化；糠醛具有苦杏仁味，EM1L115发酵后可以降低其含量，但没有EM1Y071发酵降低的幅度大。

表1 不同发酵苹果浓缩汁的香气成分

注：A-植物乳杆菌EM1L115发酵苹果汁;B-乳酸克鲁维酵母EM1Y071发酵苹果汁;C-两菌种混合发酵。(以下各图、表与此注相同)。

图1 不同发酵苹果浓缩汁香气成分的总离子流色谱图Fig.1 The total ion chromatograms of aroma components in different fermented apple juice concentrate

对比表1中未发酵和B的香气成分，乳酸克鲁维酵母单菌发酵能大大增加苹果浓缩汁中的挥发性香气成分。EM1Y071发酵产生6种酯类物质；乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯都具有醚香、甜的果香，乙酸异戊酯具有强烈的如香蕉、生梨等甜的水果香气；发酵使糠醛大量降低同时，乙酸糠酯会给浓缩汁带来坚果和焦糖香气；乙酸苯乙酯会提供果香、花香、蜜糖及热带水果香气、带有酵母香的味道；这些酯类大大丰满了寡淡的苹果浓缩汁的香气。EM1Y071代谢还产生了正丙醇、异丁醇、异戊醇、苯乙醇等高级醇，这些高级醇几乎全部是在酵母的氨基酸合成途径中形成，适量的高级醇可以提高苹果浓缩汁香气的层次感和浓郁度；异戊醇带有醇香、醚香、香蕉香，而苯乙醇具有玫瑰花甜香。在苹果酒香气的研究中，乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、正丙醇、异丁醇、异戊醇、苯乙醇均是影响苹果酒香气的重要因素[6-7]，还有研究表明乙酸乙酯是苹果浓缩汁发酵苹果酒的特有香气组分[8]；EM1Y071发酵苹果汁主导香气成分为：乙酸乙酯、异戊醇、乙酸苯乙酯，与苹果酒香气成分研究吻合，由于发酵时间短，含量上有所相差。

EM1L115与EM1Y071协调发酵与EM1Y071单菌发酵有较大的变化。主要体现在乙醇、苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸苯乙酯在发酵过程中降低，丙酸乙酯、乙酸丙酯升高；并且生成了2-乙酰基呋喃。该物质具有甜香、坚果香、烟熏香的香气特征，有研究表明乳酸菌能分解苹果酒中的柠檬酸生成双乙酰及其衍生物，提高苹果酒的风味复杂度，起到修饰作用[9]；由于发酵时间短，双乙酰及其衍生物含量低，并不会对香气造成负面影响。

2.2 不同菌种发酵苹果浓缩汁游离氨基酸测定结果及比较

不同菌种发酵苹果浓缩汁的氨基酸分析图谱见图2，不同菌种发酵苹果浓缩汁的游离氨基酸含量分析见表2。可以看出，3种发酵苹果浓缩汁的游离氨基酸变化各有不同，其中天冬氨酸含量最高，是苹果浓缩汁的主要氨基酸。

表2 不同发酵苹果浓缩汁的游离氨基酸成分

注：*表示必需氨基酸。

图2 不同发酵苹果浓缩汁的氨基酸分析图谱Fig.2 Free amino acid profiles of different fermented apple juice concentrate

对比EM1L115发酵苹果浓缩汁(A)和未发酵的苹果浓缩汁，可以发现除羟基脯氨酸外，其余成分均有不同比例的下降，造成了浓缩苹果汁风味略单薄、清淡。

EM1L115与EM1Y071协同发酵中游离氨基酸的变化能较好的反映2株菌株在苹果浓缩汁中的代谢情况。例如苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸在双菌协同发酵中的含量处于A和B之间，这4种氨基酸在EM1L115发酵中被消耗，在EM1Y071发酵中有所生成；从侧面的反映了酵母菌代谢可以给乳酸菌提供氨基酸等营养物质，促进乳酸菌的生长。酵母菌可以将苯丙氨酸转变为苯乙醇；对比A、B、C三者，苯丙氨酸未发酵>B>A/C，但从香气成分看，苯乙醇在混菌发酵中并没有检测出；有研究表明苹果酒在生物降酸过程中，随着乳杆菌等的苹果酸-乳酸(malolactic fermentation, MLF)发酵过程，苯乙醇也会随之降低[12]。从呈味氨基酸来看，协同发酵缬氨酸、异亮氨酸、赖氨酸双菌发酵降幅高于酵母菌发酵，苦味氨基酸下降使协同发酵苹果浓缩汁更为甜醇。

2.3 不同菌种发酵苹果浓缩汁有机酸测定结果及比较

表3是发酵苹果浓缩汁有机酸测定结果，由于酒石酸均未检测出，因此表中未显示。植物乳杆菌是同型发酵乳酸菌，有机酸中乳酸增长较为明显，由于发酵温度处于30 ℃，且苹果浓缩汁酸度较高，乳酸的增长速率并不大。EM1Y071单菌发酵中主要是柠檬酸的上升，酵母在三羧酸循环中会生成柠檬酸中间产物；但酵母菌代谢并不产生乳酸，而B中乳酸有所上升，此情况与汤云成在研究酿酒酵母在葡萄汁发酵中代谢流构建中一致，其中酵母-乳酸关系原理依然不明[13]。C的有机酸含量对比A、B，乳酸、乙酸进一步增加，柠檬酸和苹果酸含量降低。分析认为一方面取决于双菌协同发酵有促进作用，促使代谢活动增强；另一方面得益于EM1L115的MLF过程。苹果酸-乳酸发酵在果酒发酵中有重要的意义，可以使得果酒酸涩、粗糙等特点消失，提高酒体稳定性，整体风味呈现柔和、丰满、醇香增强的效果[14]。主要是由于乳杆菌等可以利用苹果酸-乳酸酶催化苹果酸转变为乳酸；伴随此过程中，还会分解浓缩汁中的糖、柠檬酸等成分，生成乙酸及微量双乙酰及其衍生物。因此C中乳酸、乙酸的增加，苹果酸的降低也符合代谢规律。

表3 不同发酵苹果浓缩汁的有机酸成分

3 讨论

选用植物乳杆菌、乳酸克鲁维酵母短时间发酵苹果浓缩汁，一方面保证苹果浓缩汁乙醇含量较低，使其可以广泛应用在酒类、甜品、饮料等多方面领域；另一方面菌种发酵后能很好的改善苹果浓缩汁风味寡淡的缺点，利用发酵形成多风味方向的苹果浓缩汁。

植物乳杆菌EM1L115发酵对苹果浓缩汁风味物质影响主要是有机酸的改变；乳酸克鲁维酵母EM1Y071的发酵苹果浓缩汁，乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、异戊醇等是香气成分的主体骨架，在发酵过程中消耗了大部分苦味氨基酸，对苹果浓缩汁风味有大大的改善；2株菌株协同发酵后，香气成分和有机酸成分的变化是造成酵母单菌和协同发酵风味迥异的原因，一方面是菌株代谢存在协同促进，另一方面得益于EM1L115苹果酸-乳酸发酵。虽然发酵苹果浓缩汁中香气成分是痕量上的变化，但感官上差异明显。发酵苹果浓缩汁的游离氨基酸变化与菌株代谢活动密切。

本研究主要初步探讨了不同菌种短时发酵苹果浓缩汁中风味物质的变化，但由于是短时发酵，一部分痕量香气成分有可能未分析检测到但对风味有所影响，而氨基酸、有机酸的含量一直处于动态变化中，对于不同菌株发酵过程，并没有进行动态变化跟踪和代谢监控。后期试验既可以深入研究不同发酵条件对单一菌种发酵苹果浓缩汁风味的影响，还能延长发酵时间，深入分析酵母菌、乳酸菌、多菌协同发酵的氨基酸、有机酸等代谢机理和关键酶类，对果汁加工业、果酒加工业中起到理论指导作用。

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Analysis on flavor compounds of concentrated apple juice fermented by different strains

WANG Xin-yue, CAO Shao-jun, ZHAO Hua-jie, QIN Jing, WU Xiao-dan, HU Xiao-hui, CHEN Rong-rong*

(Ever Maple Food Science & Technology Co., Ltd., Hangzhou 311215, China)

The aroma components, free amino acids, and organic acids of concentrated apple juice and corresponding changes before and after fermentation byLactobacillusplantarumstrain EM1L115 orKluyveromyceslactisstrain EM1Y071 were comparatively analyzed. Results showed that flavor compounds of concentrated apple juice fermented withL.pEM1L115 had no significant change, except that more lactic acid was detected. When the concentrated apple juice was fermented with single strainK.lactisEM1Y071 or cooperative fermentation withK.lactisEM1Y071 andL.pEM1L115, significant changes of volatile flavor compounds were detected due to changes of ester, alcohols, amino acids and organic acids after fermentation. This article provides the basic theory for flavor control and metabolic regulation on fermentation of fruit and vegetables.

fermented apple juice concentrate;Kluyveromyceslactis;Lactobacillusplantarum; aroma components; free amino acids; organic acids

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201704038

硕士研究生(陈荣荣高级工程师为通讯作者，E-mail：rongrong.chen@h-shgroup.com)。

2016-10-24，改回日期：2017-01-04