郫县豆瓣发酵过程可培养细菌多样性及其演化分析

关统伟，王鹏昊，邓奥宇，田蕾，董丹，赵顺先，向慧平，张习超

(西华大学 微生物研究所，食品生物技术四川省高校重点实验室，四川 成都，610039)

郫县豆瓣发酵过程可培养细菌多样性及其演化分析

关统伟*，王鹏昊，邓奥宇，田蕾，董丹，赵顺先，向慧平，张习超

(西华大学 微生物研究所，食品生物技术四川省高校重点实验室，四川 成都，610039)

以郫县豆瓣不同发酵期的样品为原料，采用6种培养基分离，经过系统发育分析，共获得11个属的细菌(Bacillus、Oceanobacillus、Halomonas、Lactobacillus、Virgibacillus、Aidingimonas、Pantoea、Weissell、Enterobacter、Glycomyces和Gracilibacillus)，其中芽孢杆菌属细菌种类最为丰富。Bacillus、Oceanobacillus、Halomonas、Lactobacillus、Virgibacillus、Weissella、Enterobacter和Gracilibacillus伴随于豆瓣发酵的整个过程，其中Bacillus、Oceanobacillus和Halomonas是郫县豆瓣发酵过程中的优势菌群，占可培养细菌总量的84.9%。郫县豆瓣细菌多样性丰富，并且存在着新的细菌种类，其中菌株XHU5999与已知同源关系最近的菌株Glycomyceshalotolerans相似性仅为96%；菌株XHU5135与Aidingimonashalophila的同源性最近，相似性为97%。研究结果表明，郫县豆瓣在发酵过程中丰富的细菌种类和数量是随着环境变化而变化的，细菌在豆瓣风味形成过程中扮演着重要角色。

郫县豆瓣；发酵过程；细菌多样性；动态分析

郫县豆瓣凭借其独特的原料(四川和云南的优质蚕豆以及郫县及其周边的二荆条辣椒)，特殊的长时间开放式传统发酵工艺(制曲、固态发酵和长期陈酿，涉及到自然界众微生物菌系的参与)[1-3]和区域性小气候(温度、湿度等环境)最终酿成了风味独特、营养健康且不可复制的国家地理标志产品。300年以来，郫县豆瓣始终秉承开放式传统工艺，使得大量空气、原材料、工具、设备等环境中的细菌参与了郫县豆瓣的发酵生产。开放式自然环境细菌发酵经常引起产品涨袋，造成严重的经济损失；而且不同季节的环境微生物不同，使得不同季节产品的风味差异大，稳定性难以保障，不利于工业化生产。虽然有一些学者从郫县豆瓣的制曲阶段和发酵阶段分离到不同的细菌纯培养，如乳酸菌、芽孢杆菌等[4-6]，但目前对其发酵过程的细菌纯培养并没有系统全面的研究。本研究利用多种培养基获取不同发酵时期的细菌纯培养，探讨其细菌种群及其消长情况，为郫县豆瓣的纯种发酵、质量控制和工艺优化提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

Goldview、EDTA、Tris碱等，上海生工生物工程有限公司；甘油、无水乙醇、异戊醇等，成都市科龙剂化工厂；pGM-T试剂盒、Extaq DNA聚合酶、dNTP等，大连宝生物公司；胰蛋白酶、蛋白酶K等，Sigma公司；生化培养箱，上海福玛实验有限公司；台式高速离心机，湘仪离心机有限公司；PCR仪，美国Bio-Rad公司。

1.2 实验材料

实验材料为郫县豆瓣，采集于四川恒丰和食品有限公司。试验中总共采集了6个发酵时期的样本，豆瓣样本编号分别为： BZ1、BZ5、BZ10、PJ3、HE1和HE5。样品采集使用多点取样法，通过在发酵池的两端以及中间3个位置分别取上、中、下层等量豆瓣样品，混合均匀备用。6个时期的样本信息分别为：编号BZ1、BZ5、BZ103个样本分别在2013年11月30日(瓣子发酵1个月)、2014年3月30日(瓣子发酵5个月)和2014年8月30日(瓣子发酵10个月)取样；编号PJ3(取样时间为2014年9月1日)来自发酵3个月成熟辣椒醅；编号HE1和HE5(分别取2014年10月30日和2015年2月30)来自混合发酵阶段，混合发酵时间分别为1个月和5个月。

1.3 实验方法

1.3.1 分离培养基

为了全面反映豆瓣发酵过程中的细菌情况，结合生态环境，实验人员采用了以下6种培养基，用于分离豆瓣酱中的细菌。

CM培养基：酪素水解物7.5 g，酵母粉10 g，柠檬酸三钠3 g，MgSO40.1 g，KCl 2 g，NaCl 1 g；

ACM培养基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g；

MM培养基：葡萄糖0.5 g，酵母抽提物0.5 g，K2HPO4, 1 g，NaCl, 0.5 g，MgSO4. 7H2O, 0.5 g；

MAM培养基：麦芽汁抽提物20 g，蛋白胨1 g，葡萄糖20 g；

SDA培养基：蛋白胨10 g，麦芽糖40 g，KCl 1 g，1 mL精滤发酵豆瓣液；

YC培养基：酵母抽提物(Difco)2 g、酪蛋白氨基酸(Difco)2 g、谷氨酸钠1 g、柠檬酸钠3 g、MgSO41 g、CaCl21 g、KCl 1 g、FeCl2·4H2O 0.3 g、MnCl2·4H2O 0.3 g。

以上培养基采用不同盐浓度梯度(原培养基及分别补充5%、10%、15%、20%的NaCl)，补水至1 L，溶解混匀，制备成无菌培养基进行样品分离。

1.3.2 菌株的分离

无菌操作条件下，选取采集的豆瓣酱样品1 g，放于100 mL无菌生理盐水中，37 ℃恒温200 r/min摇床过夜，制成10-2悬浊液。吸取0.1 mL悬浊液均匀涂布于预先配置好的固体培养基平板上，37 ℃下恒温保湿培养，以减少培养基水分的散失，延长培养时间。

1.3.3 菌株的DNA的提取与PCR扩增

菌株总DNA的提取、16S rRNA基因的PCR扩增均采用CUI等[7]使用的方法进行。以提取得到的DNA为模板，选择细菌通用引物Eμ27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)；1490R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。反应条件：95 ℃ 4 min；95 ℃ 60 s，56 ℃ 60 s，72 ℃ 120 s，35个循环；72 ℃ 10min。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物的纯化参照OMEGA公司E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit试剂盒的说明进行。PCR产物纯化后送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.3.4 菌株16S rDNA基因系统发育分析

测序结果提交NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行Blast(Basic Local Alignment Search Tool)序列比对分析。系统进化矩阵根据Kimura模型估算[8], 用MEGA6.0(Molecular Evolutionary Genetics Analy-sis)软件采用邻接法(Neighbor-Joining)聚类分析构建出系统进化树[9]。同时, 重复取样1 000次进行自展值(bootstrap value)分析来评估系统进化树的拓扑结构的稳定性。定义16S rRNA基因序列相似性低于98%作为不同的分类单元，相似性大于98%的归于同一个物种来计算[10]。

1.3.5 细菌菌落数量统计

食品中细菌总数的检测采用平板计数法，参照GB 4789.2—2010操作进行。培养基采用GB4789.2—2010中介绍的平板计数琼脂(plate count agar，PCA)，选取菌落数在30～300 CFU、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。

2 实验结果

2.1 郫县豆瓣发酵过程可培养细菌多样性动态分析

通过6种培养基对郫县豆瓣发酵过程中的细菌进行分离，共获得322株菌。经过16S rRNA测序与序列比对，结果发现郫县豆瓣发酵过程中存在众多细菌的参与，共分离到11个属的菌株，分别属于细菌域的芽孢杆菌属(Bacillus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、艾丁单孢菌属(Aidingimonas)、盐单孢菌属(Halomonas)、乳杆菌属(Lactobacillus)、枝芽孢菌属(Virgibacillus)、魏斯氏菌属(Weissella)、糖霉菌属(Glycomyces)、泛菌属(Pantoea)、肠杆菌属(Enterobacter)和糖球菌属(Gracilibacillus)(如表1所示)。

表1 不同发酵期郫县豆瓣可培养细菌多样性动态变化

续表1

菌号相似性/%同源菌种BZ1BZ5BZ10PJ3HE1HE5XHU5943100Bacilluscereus+-+--+XHU541099Bacillusmethylotrophicus++--+-XHU5511100Bacillussubtilis++++--XHU5499100Bacillussafensis+-+++-XHU5413100Bacillusstratosphericus-+-+--XHU5624100Bacillusniabensis--+-+-XHU5555100Lactobacillusplantarum++--++XHU551699Oceanobacilluspicturae++++-+XHU5517100Oceanobacillusoncorhynchi+-+-+-XHU599996Glycomyceshalotolerans++----XHU561299Halomonasalkaliphila+-++-+XHU5491100Halomonaselongate+++-++XHU582099Enterobacterasburiae+---++XHU5821100Gracilibacillusdipsosauri+--+--XHU5672100Virgibacilluspicturae++--+-XHU582399Virgibacillussalarius+-+-+-XHU513597Aidingimonashalophila---++-XHU590199Weissellacibaria-++-++XHU572799Pantoeaagglomerans---+--

注：+，阳性；-，阴性，即没分离到该细菌。

这些细菌的属中Bacillus分离得到的数量最多，占全部细菌总数的52.3%，其次是Oceanobacillus(17.4%)和Halomonas(15.2%)；其余8个属的菌株所在比例较少，占15.1%的细菌总量，且Lactobacillus仅占1.7%。研究中发现2个值得关注的细菌，菌株XHU5135与Aidingimonashalophila(喜盐艾丁单孢菌)的同源性最近，相似性为97%，在系统树中形成一个独立的分支，是一个潜在的细菌新种(如图1系统发育树所示)；菌株XHU5999与目前已知同源关系最近的菌株Glycomyceshalotolerans(耐盐糖霉菌)相似性仅为96%，是一个新的细菌物种(如图2系统发育树所示)，其余其他菌株与已知菌株的相似性为99%～100%。

图1 菌株XHU5135的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of the strain XHU5135 and near neighbours calculated from 16S rRNA gene

由表1可知，郫县豆瓣传统发酵过程中不同时期(BZ1、BZ5、BZ10、PJ3、HE1、HE5)可培养细菌组成具有较大差异。发酵初期的BZ1样品中细菌多样性最为丰富，共分离获得8个属的细菌，分别为：Bacillus、Oceanobacillus、Halomonas、Lactobacillus、Virgibacillus、Enterobacter、Glycomyces和Gracilibacillus。这可能经过制曲阶段，霉菌产生多种淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等将原料中的大分子物质(如淀粉和蛋白质)分解成小分子的氨基酸、有机酸、葡糖糖的缘故，使得瓣子加盐发酵的初期豆瓣酱中的营养物质极其丰富，原料和环境中的细菌大量进入发酵体系，成为细菌生长繁殖的主要碳源和氮源来源。因此，该时期微生物的生长旺盛，种类丰富。发酵5个月后的BZ5样品中总共获得7个属，分别为：Bacillus、Oceanobacillus、Virgibacillus、Lactobacillus、Halomonas、Weissella和Glycomyces。瓣子发酵10个月的BZ10Y样品中总共分离得到5个属的细菌，即Bacillus、Halomonas、Oceanobacillus、Virgibacillus和Weissella，该时期的属一级的物种多样性较少，可能是由于高浓度的盐水，无氧的环境、pH值下降以及营养物质的消耗有关，使得部分细菌在该时期无法生长；还有些细菌可能由于分离与培养条件的限制没有分离出来。成熟辣椒醅PJ3样品中分离获得6个属的细菌，分别为Gracilibacillus、Bacillus、Oceanobacillus、Halomonas、Aidingimonas和Pantoea。 HE1样品分离得到8个属的细菌(Bacillus、Oceanobacillus、Halomonas、Lactobacillus、Virgibacillus、Aidingimonas、Enterobacter和Weissella)，该时期为BZ10Y与椒胚PJ3混匀发酵的初期，一部分细菌是两个时期微生物组成的叠加，但同时，该时期再次出现了乳杆菌属(Lactobacillus)和肠杆菌属(Enterobacter)2个属，是在BZ10Y和PJ3Y样品中未检测得到的，可能是受分离条件的影响，亦或是在混合操作中引入的环境细菌。从HE5样品中获得了6个属的细菌，即Bacillus、Oceanobacillus、Halomonas、Lactobacillus、Enterobacter和Weissella。从各时期的细菌组成不难看出，在豆瓣酱发酵的各时期，Bacillus、Oceanobacillus、Halomonas、Lactobacillus、Weissella和Enterobacter始终伴随于整个发酵过程，是主要的郫县豆瓣菌群。另外，值得注意的是，芽孢杆菌属是郫县豆瓣发酵过程中发现的可培养细菌9个属中最为富的一个类群，共有12个不同的种，它们可能对郫县豆瓣的呈香具有重要的作用，值得深入研究。而其他属的细菌种的多样性相对较少，除了Oceanobacillus、Halomonas和Virgibacillus各有2个不同种外，其他属仅仅有1个种。

图2 菌株XHU5999的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of the strain XHU5135 and nearneighbours calculated from 16S rRNA gene

2.2 不同发酵时期细菌总数的动态变化

郫县豆瓣不同发酵时期的6个样品(BZ1、BZ5、BZ10、PJ3、HE1、HE5)的细菌菌落总数变化较大(图3)。在BZ1中细菌菌落总数最多，为18.3×105CFU/g；随后由于盐浓度的增高、养分的不断消耗以及不适应生活环境细菌的死亡，在BZ10时期，菌落总数降到最低(2.2×105CFU/g)，与BZ1相比，减少了1个数量级。随辣椒醅PJ3样品环境细菌(12.6×105CFU/g)的加入，在HE1阶段，细菌菌落总数上升为10.1×105CFU/g，但在HE5时期的细菌菌落总数又出现了明显的下降，可能是辣椒醅中的部分细菌不适应混合环境的缘故，造成部分细菌死亡，数量减少。这些变化也说明，不同发酵周期的环境因素对豆瓣细菌的繁殖具有重要影响。

图3 不同发酵时期郫县豆瓣细菌总数变化Fig.3 Change of bacterial quantity in different fermentation processes from Pixian bean paste

3 结论

(1)郫县豆瓣发酵过程中存在丰富的细菌多样性，共获得11个属的细菌，其中芽孢杆菌属的种类最为丰富。赵辉平等[5]从郫县豆瓣中分离得到了8个属的细菌，芽孢杆菌属也是优势菌群，这与我们的研究基本一致。本研究在瓣子发酵过程中获得了Bacillus、Oceanobacillus、Halomonas、Lactobacillus、Virgibacillus、Weissella、Glycomyces、Enterobacter和Gracilibacillus9个属的细菌；在辣椒醅中共分离得到Bacillus、Oceanobacillus、Halomonas、Aidingimonas、Pantoea和Gracilibacillus6个属的细菌，并且Aidingimonas和Pantoea仅在辣椒醅中得到，而Lactobacillus、Virgibacillus、Weissella、Glycomyces和Enterobacter在辣椒醅中没有获得，应该是来源于甜瓣子发酵。这些细菌伴随着整个豆瓣发酵过程，可能对豆瓣风味的形成具有重要影响。以前的研究主要探索了真菌(霉菌和酵母菌等)对郫县豆瓣风味形成的重要影响[11-12]，但是，这些真菌大多存在于制曲阶段或者发酵初期的1个月，由于高盐度环境的影响，以后的发酵中这些真菌极少出现，而细菌始终伴随着郫县豆瓣的发酵。客观上，发酵时间越久郫县豆瓣的酱酯香则越浓郁，产品质量越好。因此，细菌在豆瓣长时间发酵呈香方面扮演着极其重要的作用，而细菌对于郫县豆瓣的呈香的贡献极少有文献报道，这将限制人们对细菌发酵郫县豆瓣风味物质形成机理的深入认识。

(2)首次在郫县豆瓣中获得Aidingimonas、Glycomyces和Pantoea属的细菌纯培养。纯培养条件对于豆瓣环境中的细菌而言始终是一种制约，世界上也没有一种万能的培养基可以完成所有环境微生物的分离。因此，要想更好地反映郫县豆瓣细菌的实际情况，还需设计更多的培养基，并结合宏基因组学技术全面系统阐述。可喜的是，菌株XHU5999和XHU5135与已知的物种同源性都低于98%，STACKEBRANDT和EBERS(2006) 建议原核生物之间98.7%的同源性作为判断菌株是否为新物种的金标准[14]。因此，XHU5999和XHU5135是郫县豆瓣发酵细菌中的2个新物种。从表1可以看出，XHU5999来源于豆瓣中，而XHU5135来源于辣椒醅中。这2株菌的同源菌株都具有耐盐性，那么这2株菌是郫县豆瓣长期发酵自然形成的土著细菌，还是自然环境随意带入的杂菌，以及在豆瓣发酵中起什么作用等值得深入研究。

(3)Bacillus、Oceanobacillus和Halomonas是郫县豆瓣发酵过程中的优势菌群，占可培养细菌总量的84.9%，并且伴随于豆瓣发酵的整个过程(表1)，对豆瓣风味的影响起着重要作用，比如Bacillus属的菌株通常具有很好的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶活性，它们的酶解产物是美拉德反应的重要物质基础，有些产物本身就是风味成分。另外，Lactobacillus、Virgibacillus、Weissella、Enterobacter和Gracilibacillus也是分布于豆瓣发酵的整个周期(表1)，对豆瓣发酵呈香有一定贡献，如Lactobacillus发酵产生的乳酸与酵母菌发酵产生的醇类酯化为风味物质；Pantoea属的细菌兼性厌氧，是具有代谢和发酵类型的化能异养菌，发酵D-葡萄糖和其它糖类可产酸；Weissella属的菌株常用于酱油发酵等。这些菌株在郫县豆瓣发酵中的功能特性都值得深入探讨。

(4)整个发酵过程中，细菌数量一直处于动态变化中。从最初的样品BZ1中，细菌的数量是最多的，在发酵10个月(BZ10)后，受环境变化因素影响，细菌数量达到了最低水平(2.2×105个CFU/g)。随着辣椒醅的融入发酵，细菌数量明显提升，说明辣椒醅中的许多细菌是适应于豆瓣发酵的，并对环境变化具有很好的适应性。

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Phylogenetic diversity and change of culture-dependent bacteria of Pixian bean paste during fermentation processes

GUAN Tong-wei*, WANG Peng-hao, DENG Ao-yu, TIAN Lei, DONG Dan, ZHAO Shun-xian, XIANG Hui-ping, ZHANG Xi-chao

(Xihua University Institute of Microbiology, Food Biotechnology Laboratory of Sichuan Universities, Chengdu 610039，China)

Bacterial diversity and change of Pixian bean paste during fermentation processes were investigated using culture-dependent method. These bacteria isolated by 6 different media belonged to 11 genera based on 16S rRNA gene sequences analysis, namelyBacillus,Oceanobacillus,Halomonas,Lactobacillus,Virgibacillus,Aidingimonas,Pantoea,Weissell,Enterobacter,GlycomycesandGracilibacillus. Of all the bacteria, species of theBacillusgenus was one of the most abundant.Bacillus,Oceanobacillus,Halomonas,Lactobacillus,Virgibacillus,Weissella,EnterobacterandGracilibacilluswas in all fermentation processes andBacillus.OceanobacillusandHalomonaswere predominated microorganism with corresponding percentage of 84.9%. Phylogenetic analysis showed that strain XHU5999 having lower 16S rRNA gene sequence similarity of 96% withGlycomyceshalotoleransand strain XHU 5135 was the most closely related strain toAidingimonashalophila(97%). The two strains should be designated as two novel species. The results showed that species and quantity of bacteria were changed with environmental change, and they played an important role in flavor formation of Pixian bean paste during fermentation.

Pixian bean paste; fermentation processes; bacterial diversity; dynamic analysis

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201704004

博士，副教授(本文通讯作者，E-mail: guantongweily@163.com)。

食品生物技术四川省高校重点实验室(Szjj2013-045)；企业委托项目(15205206、16205224、15205213)资助

2016-10-20，改回日期：2016-12-18