短乳杆菌ZLB004发酵培养基的优化研究

2017-06-19刘辉季海峰王四新张董燕张伟王晶单达聪王雅民

中国饲料 2017年11期

关键词：酵母粉响应值氮源

刘辉，季海峰，王四新，张董燕，张伟，王晶，单达聪，王雅民

（北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京100097）

短乳杆菌ZLB004发酵培养基的优化研究

刘辉，季海峰*，王四新，张董燕，张伟，王晶，单达聪，王雅民

（北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京100097）

为得到短乳杆菌ZLB004最佳发酵培养基，本试验研究了不同碳源、氮源、缓冲盐、微量元素对短乳杆菌活菌数的影响，并利用响应面分析法对筛选出的主培养基成分进行了优化，得到短乳杆菌ZLB004的发酵培养基为：葡萄糖31.4 g/L、酵母粉3.5 g/L、牛肉膏8.5 g/L、牛肉蛋白胨10 g/L、乙酸钠7.5 g/L、柠檬酸氢二铵3 g/L、磷酸氢二钾3 g/L、硫酸锰0.2 g/L、硫酸锌0.6 g/L、吐温-80 1 ml/L、pH 6.5。短乳杆菌ZLB004在此培养基中37℃培养24 h，活菌数可达3.15×109cfu/mL，是优化前活菌数的4.03倍。

短乳杆菌ZLB004；发酵培养基；响应面；优化

乳酸菌是一类可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称，因其具有营养、抑菌、免疫调节等多种生物学功能（李瑞等，2013；Xie等，2011），在畜牧生产中得到广泛的研究和应用。乳酸菌对营养的要求特殊而复杂，正常生长不仅需要碳源、氮源、缓冲盐、微量元素等营养物质，而且营养物质的组成及配比对菌体生长影响重大（刘辉等，2016；Dumbrepatil等，2008），因此需要对营养物质组成和配比进行优化，筛选出适合乳酸菌生长的培养基。

短乳杆菌ZLB004（Lactobacillus brevis ZLB004）是分离自健康断奶仔猪肠黏膜中的一株优良乳酸菌，具有较强的耐酸、耐胆盐性，动物试验表明，该菌在改善肠道菌群、增加营养物质利用率、增强机体免疫力、提高生长性能等方面具有良好的效果（Liu等，2015；刘辉等，2013）。为了提高短乳杆菌ZLB004发酵液中的活菌数，本试验在单因素试验的基础上，通过响应面法优化发酵培养基，以期为该菌株的发酵生产提供基础。

1 材料与方法

1.1 菌株L.brevis ZLB004分离自健康断奶仔猪肠黏膜，已通过中国普通微生物菌种保藏管理中心鉴定，由本研究室保藏。

1.2 培养基MRS培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，乙酸钠5 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，柠檬酸氢二铵2 g/L，硫酸镁0.58 g/L，硫酸锰0.19 g/L，Tween-80 1 mL/L，pH值6.5。121℃灭菌15 min。

1.3 活化与接种发酵L.brevis ZLB004菌株保存于-80℃冰箱，使用前按1%的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃培养24 h，活化两代。活化后的菌种以1%接种量接种于相应的培养基中，37℃培养24 h后测定菌体生长情况。

1.4 活菌计数采用菌落平板计数法计算发酵液中的活菌含量：将发酵液用灭菌生理盐水进行十倍梯度稀释，选择合适的3个梯度进行平板涂布，每个梯度设3个平行，37℃培养48 h计菌落总数。

1.5 单因素试验筛选培养基营养成分在MRS培养基的基础上，固定其他成分，采用不同的碳源和氮源分别取代MRS中的碳源和氮源配制培养基，接种发酵，根据菌体生长情况对其最优碳源和氮源进行判断和筛选；在碳氮源优化的基础上，分别添加不同的缓冲盐体系和微量元素，接种发酵，根据菌体生长情况，确定缓冲盐体系和微量元素的种类。

1.6 响应面法优化主培养基

1.6.1 Plackett-Burman（P-B）试验设计筛选显著影响因子采用P-B两水平法，选用试验次数N=12试验设计，对筛选出的碳源、氮源、缓冲盐、微量元素等9种因素进行考察，每个因素各取2个水平，以短乳杆菌发酵液的活菌数为响应值，筛选出对短乳杆菌活菌数影响显著的因素（Soliman等，2005）。

1.6.2 最陡爬坡试验设计确定重要影响因素的水平对P-B试验设计筛选得到的显著影响因素进行最陡爬坡试验，确定最陡爬坡试验的方向和梯度，进而确定试验因素的中心点。

1.6.3 响应面分析法确定最大响应值用Box-Behnken法，根据最陡爬坡试验确定的试验因素中心点设计响应面因素及水平，以活菌数为响应值，采用minitab 16软件对数据进行二次多项回归拟合，得到一个响应变量与自变量之间的模型。根据建立的模型计算得到L.brevis ZLB004的最佳增殖培养基配方。

1.6.4 验证试验将活化好的种子液按1%的比例分别接种至普通MRS培养基和1.6.3响应面设计得到的增殖培养基中，37℃培养48 h计菌落总数。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验筛选培养基营养成分

2.1.1 不同碳源对活菌数的影响碳源物质是构成培养基的主要成分之一，能够提供细胞物质中的碳素来源和微生物生长发育过程中所需要的能量。不同碳源对L.brevis ZLB004活菌数的影响见图1。由图1可知，以葡萄糖为培养基唯一碳源时，短乳杆菌的活菌数最高，为7.6×108cfu/mL，远高于其他11种碳源，因此选择葡萄糖作为最佳碳源进行后续试验。

图1 不同碳源对L.brevis ZLB004活菌数的影响

2.1.2 不同氮源对活菌数的影响选择10种常用的有机氮源和无机氮源，其对L.brevis ZLB004活菌数的影响见图2。由图2可知，与无机氮源相比，有机氮源更适合短乳杆菌的生长，并且当氮源为牛肉蛋白胨、牛肉膏和酵母粉时，短乳杆菌的活菌数优于其他几种。乳酸菌对氮源的需求比较高，而复合氮源比单一氮源更有利于乳酸菌的生长（Vinodh等，2011），综合考虑，选择牛肉蛋白胨、牛肉膏和酵母粉作为后续研究的氮源。

图2 不同氮源对L.brevis ZLB004活菌数的影响

2.1.3 不同缓冲盐对活菌数的影响在前面碳氮源优化的基础上，添加5种不同的缓冲盐体系，根据短乳杆菌菌体生长情况，确定最优的缓冲盐体系。由图3可知，不同的缓冲盐对菌体的增殖效果各不相同，其中以柠檬酸氢二铵/乙酸钠/磷酸氢二钾缓冲体系对菌体的促生长效果最好，因此选择此缓冲盐体系作为优化培养基的缓冲盐。

2.1.4 不同微量元素对活菌数的影响分别以硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）、硫酸镁（MgSO4·7H2O）、硫酸铜（CuSO4）、硫酸锌（ZnSO4·7H2O）和硫酸锰（MnSO4·5H2O）等5种微量元素，加入不含硫酸镁和硫酸锰的优化培养基中，测定各培养基的活菌数。由图4可知，硫酸锰和硫酸锌对短乳杆菌的促生长作用最为突出，而硫酸镁、硫酸亚铁和硫酸铜的作用较弱。微量元素可作为酶的激活剂或生物活性物质的组成成分，对微生物的生长繁殖具有十分重要的作用，综合考虑，选择硫酸锰和硫酸锌作为优化培养基的微量元素。

图3 不同缓冲盐对L.brevis ZLB004活菌数的影响

图4 不同微量元素对L.brevis ZLB004活菌数的影响

2.2 响应面法优化主培养基

2.2.1 Plackett-Burman试验设计及结果试验设计及结果见表1，各因素水平及主效应分析见表2。由表2可以看出，在这9个因素的主效应中，葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸氢二铵、磷酸氢二钾和硫酸锌对响应值（活菌数）表现为正效应，牛肉蛋白胨、牛肉膏、酵母粉和硫酸锰表现为负效应。其中酵母粉、牛肉膏和葡萄糖对响应值有显著影响（可信度大于95%，即主效应P＜0.05），因此可作为显著因素进行下一步试验。

2.2.2 最陡爬坡试验设计及结果根据P-B试验筛选出的显著因素的效应大小，确定最陡爬坡试验的方向和步长，试验设计及结果见表3。由表3可以看出，随着酵母粉、牛肉膏质量浓度降低、葡萄糖质量浓度的升高，活菌数呈现先上升后下降的变化趋势，活菌最高的响应值区域在第4组试验，因此以第4组因素的水平作为响应面试验设计的中心点，即酵母粉3.5 g/L、牛肉膏8.5 g/L、葡萄糖31.5 g/L。

表1 Plackett-Burman试验设计及响应值

表2 Plackett-Burman试验设计的因素水平及效应分析

表3 最陡爬坡试验设计及结果

2.2.3 响应面分析法确定最大响应值根据P-B试验、最陡爬坡试验，以及Box-Behnken的中心组合设计原理，设计3因素3水平的响应面试验，以酵母粉、牛肉膏和葡萄糖3个因素为自变量，以短乳杆菌的活菌数为响应值，根据最陡爬坡试验的结果确定试验中心和水平。试验因素与水平的选取见表4，Box-Behnken试验设计及结果见表5。

表4 Box-Behnken试验因素与水平

表5 Box-Behnken试验设计及结果

根据表5结果，用Minitab16软件对数据进行二次回归分析，得到的回归方程为：Y=3.21667+ 0.195X1+0.0675X2+0.0325X3-0.36208X12-0.23208X22-0.22208X32+0.0025X1X2-0.0225X1X3-0.0775X2X3。

式中：Y为短乳杆菌ZLB004菌体浓度的预测响应值；X1、X2、X3分别为酵母粉、牛肉膏和葡萄糖的编码值。

由表6可以看出，X1、X12、X22及X32对短乳杆菌活菌数有极显著的影响（P＜0.01）。由表7可知，回归方程P值为0.004，小于0.01，为非常显著。模型失拟项P值为0.224，大于0.05，不显著，说明所得数据拟合效果较好。相关系数R2= 0.9647，R2（调整）=0.9012，大于0.9，说明模型相关度很好。所以，能采用此模型来分析和预测短乳杆菌ZLB004的活菌数。

表6 回归方程中回归系数的估计值

表7 回归方程的方差分析

根据上述回归方程绘出响应面分析图及等高线图，以确认酵母粉、牛肉膏和葡萄糖3个因素对短乳杆菌ZLB004活菌数的影响，响应面图和等高线图见图5。由图及软件分析可知，所得拟合回归方程存在稳定点，即极大值点。根据Minitab软件得到的回归方程可计算得到，短乳杆菌活菌数的最大预测值为3.2×109cfu/mL，此时酵母粉质量浓度为3.5 g/L，牛肉膏质量浓度为8.5 g/L，葡萄糖质量浓度为31.4 g/L。

2.2.4 验证试验为了验证模型预测的准确性，采用优化培养基重复试验3次，发酵液中短乳杆菌ZLB004的平均活菌数为3.15×109cfu/mL，与响应面预测的最大活菌数3.2×109cfu/mL接近，误差为1.56%，这表明该模型能够很好地预测试验结果。与优化前的活菌数（7.85×108cfu/mL）相比，优化后的活菌数提高了4.03倍，达到了优化培养基的目的。

图5 各因素交互作用响应面分析图与等高线图

3 结论

以短乳杆菌ZLB004为试验菌种进行发酵培养基的优化，经过单因素试验以及响应面试验设计分析，最终确定了最佳的发酵培养基配方为：酵母粉3.5 g/L、牛肉膏8.5 g/L、葡萄糖31.4 g/L、牛肉蛋白胨10 g/L、无水乙酸钠7.5 g/L、柠檬酸氢二铵3 g/L、磷酸氢二钾3 g/L、硫酸锰0.2 g/L、硫酸锌0.6 g/L、吐温-80 1 mL/L。短乳杆菌ZLB004在此培养基中以1%接种量，37℃培养24 h，活菌数可达到3.15×109cfu/mL，是优化前活菌数的4.03倍，可以为短乳杆菌ZLB004的规模化生产提供基础。

[1]李瑞，侯改凤，黄其永，等.德氏乳杆菌对哺乳仔猪生长性能、血清生化指标、免疫和抗氧化功能的影响[J].动物营养学报，2013，25（12）：2943～2950.

[2]刘辉，季海峰，王四新，等.饲用乳酸菌高密度培养的研究进展[J].中国饲料，2016，4：11～14.

[3]刘辉，季海峰，张董燕，等.饲粮添加短乳杆菌对生长猪生长性能和血清生化指标的影响[J].动物营养学报，2013，25（1）：182～189.

[4]Dumbrepatil A，Adsul M，Chaudhari S，et al.Utilization of molasses sugar for lactic acid production by Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii mutant Uc-3 in batch fermentation[J].Appl Environ Microb，2008，74（1）：333～335.

[5]Liu H，Ji H F，Zhang D Y，et al.Effects of Lactobacillus brevis preparation on growth performance，fecal microflora and serum profile in weaned pigs[J]. Livest Sci，2015，178：251～254.

[6]Soliman N A，Berekaa M M，Abdel-Fattah Y R.Polyglutamic acid（PGA）production by Bacillus sp.SAB-26：application of Plackett-Burman experimental design to evaluate culture requirements[J].Appl Microbiol Biot，2005，69（3）：259～267.

[7]Vinodh A E，Melanie H，Carine D，et al.Biomass production and smallscale testing of freeze-dried lactic acid bacteria starter strains for cassava fermentations[J].Food Control，2011，22（3～4）：389～395.

[8]Xie N，Cui Y，Yin Y N，et al.Effects of two Lactobacillus strains on lipid metabolism and intestinal microflora in rats fed a high-cholesterol diet[J]. BMC Complem Altern M，2011，11：53～63.■

To optimize the fermentation medium of Lactobacillus brevis ZLB004，the effects of different carbon source，nitrogen source，buffer salts and microelement on the growth of Lactobacillus brevis were studied.The enrichment medium for Lactobacillus brevis was optimized by response surface methodology，and its composition was：glucose 31.4 g/L，yeast extract 3.5 g/L，beef extract 8.5 g/L，beef peptone 10 g/L，sodium acetate 7.5 g/L，diammonium hydrogen citrate 3 g/L，K2HPO43 g/L，MnSO4·5H2O 0.2 g/L，ZnSO4·7H2O 0.6 g/L，Tween 80 1 ml/L，pH 6.5.After cultivated in enrichment medium for 24 h at 37℃，the living cells of Lactobacillus brevis ZLB004 were 3.15×109cfu/mL，which was about 4.03 times higher than previous optimization.

Lactobacillus brevis ZLB004；fermentation medium；response surface；optimization