Aβ310多价腺病毒疫苗鼻粘膜免疫阿尔茨海默病转基因鼠的炎症反应研究

2017-06-19宋贵军林璐璐辛世萌曹云鹏

中风与神经疾病杂志 2017年5期

李昱，宋贵军，林璐璐，辛世萌，曹云鹏

李昱1，宋贵军1，林璐璐1，辛世萌1，曹云鹏2

目的探讨基因重组腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG鼻粘膜免疫APPswe/PSEN1dE9双转基因鼠诱导的炎症反应。方法 18只雄性10月龄APPswe/PSEN1dE9鼠，随机分为3组，分别以Aβ3-10多价腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG、空腺病毒载体鼻粘膜免疫及Aβ1-42肽肌内注射免疫，用MTT法检测脾细胞增殖反应、ELISA法检测脾细胞培养上清和脑组织匀浆中IL-4和INF-γ水平，免疫组化法检测脑内星形胶质细胞及淋巴细胞浸润。结果 Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组，在相对应的免疫原刺激孔产生较高水平的增殖率，高于非相应免疫原刺激孔(P<0.05)，但低于ConA刺激孔(P<0.05)。皮质和海马区GFAP阳性细胞所占面积百分比为：空腺病毒载体组>Aβ1-42组>Ad-Aβ(3-10)10-CpG组。各组小鼠脑组织在血管内和脑实质偶尔发现个别CD3、CD5阳性细胞，3组没有显著差异。Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组中在其相对应的免疫原刺激时检测到较高水平的IL-4、IFN-γ。Aβ1-42组在Aβ1-42肽刺激孔的IFN-γ水平显著高于Ad-Aβ(3-10)10-CpG组在Aβ3-10肽刺激孔的IFN-γ水平(P<0.05)。Ad-Aβ(3-10)10-CpG组脑组织匀浆IL-4水平大于Aβ1-42组，但没有显著性差异(P>0.05)，Ad-Aβ(3-10)10-CpG组脑组织匀浆中IFN-γ水平显著小于Aβ1-42组(P<0.05)。结论腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG鼻粘膜免疫APPswe/ PSEN1dE9双转基因鼠主要产生Th2型免疫应答，可以减少脑内星形胶质细胞活化，未引起脑内炎症反应，即避免了Aβ1-42全肽段所引起的炎症反应。

阿尔茨海默病；淀粉样蛋白；炎症反应；星形胶质细胞

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是痴呆最常见的类型，但发病机制不明确，尚无有效的防治方法，是全世界急需解决的健康问题。早期研究发现，用Aβ1-42肽免疫PDAPP鼠可以减少脑内淀粉样沉积，使转基因鼠学习和记忆能力提高。但后期Aβ疫苗(AN1792)临床试验由于Ⅱa期临床试验6%的患者出现了中枢神经系统炎症而被迫停止。这种副作用确切原因不清楚，推测与Aβ的T细胞抗原决定簇特异性的细胞免疫应答引起的炎症反应有关[1]。后续免疫治疗研究集中在改变免疫原和免疫方式来克服不恰当的T细胞应答引起的中枢神经系统炎症。炎症反应不但是AD的主要发病机制之一[2]，而且与免疫治疗的效果及疫苗的安全性密切相关。免疫治疗后进一步激活胶质细胞吞噬，参与Aβ斑的清除，但激活的胶质细胞可释放神经毒性细胞因子进而损害脑组织[3]。一种理想的疫苗，不但要有良好的治疗效果，而且不能激活体内过度的炎症反应，引起中枢神经系统炎症。

本研究前期工作已成功构建编码10次重复N末端片段Aβ3-10和CpG序列的新型腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG，并发现鼻粘膜免疫AD转基因鼠可以减少脑内Aβ沉积并改善转基因鼠的学习和记忆功能[4，5]。本研究进一步通过脾细胞增殖反应、细胞因子测定、脑内星形胶质细胞及淋巴细胞浸润检测来探讨腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG鼻粘膜免疫APPswe/ PSEN1dE9鼠诱导的炎症反应。进一步评估腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG的安全性。

1 材料与方法

1.1 材料 18只10月龄APPswe/PSEN1dE9鼠，雄性，每只鼠出生后均完成鼠尾DNA鉴定，购自中国医科大学动物部。APPswe/PSEN1dE9鼠表达鼠/人嵌合的淀粉样蛋白前体(Mo/HuAPP695swe)和突变的人早老素1(PS1-dE9)，这两种突变与早发性AD相关。随机分为3组：Ad-Aβ(3-10)10-CpG 组、空腺病毒载体组、Aβ1-42组，每组6只。Aβ1-42多肽(AnaSpect)，完全弗氏佐剂(Sigma，USA)，不完全弗氏佐剂(Sigma，USA)，羊抗小鼠IgG-HRP(R&D)，小鼠IL-4 ELISA 试剂盒(Bender Med Systems@ BMS613)，小鼠 IFN-γ ELISA试剂盒(Bender Med Systems@ BMS006)，抗GFAP(武汉博士德)，兔抗小鼠CD3(Sigma，USA)，兔抗小鼠CD5(Sigma，USA)，兔抗小鼠CD45(Sigma，USA)。

1.2 实验动物及免疫方法 Ad-Aβ(3-10)10-CpG组：Ad-Aβ(3-10)10-CpG 10 μl(1×108PFU)鼻腔免疫；空载体组：空载体10 μl(1×108PFU)鼻腔免疫；Aβ1-42组：第1次免疫用Aβ1-42肽50 μl(100 μg)+完全性弗氏佐剂(Sigma，USA)50 μl，股四头肌肌内注射，第2次及以后免疫用Aβ1-42肽50 μl(100 μg)+不完全性弗氏佐剂(Sigma，USA)50 μl，股四头肌肌内注射，每2 w免疫1次，共免疫7次。

1.3 MTT法检测脾T淋巴细胞增殖反应新鲜脾脏置于罩在装有1640培养基的培养皿上的尼龙网(200 μm)上研磨，将细胞及培养基移至15 ml离心管，离心1000 r/min，4 ℃，10 min。弃上清，加入红细胞裂解液3 ml，混匀，室温静置5 min。加入7 ml 1640培养基，混匀，离心1000 r/min，4 ℃，10 min，重复上述过程1次。弃上清，加入含10%胎牛血清的1640培养基重悬细胞。取少量细胞液稀释50倍，用细胞计数板计数细胞，根据计数结果，将细胞液稀释至5×106/ml。将细胞液接种至96孔细胞培养板，每孔加入细胞悬液100 μl。分别设置对照孔(只加细胞液)、ConA孔(含ConA终浓度2 μg/ml的细胞液)、Aβ3-10孔(含Aβ3-10终浓度20 μg/ml的细胞液)、Aβ1-42孔(含Aβ1-42终浓度20 μg/ml的细胞液)，每种刺激因素设6个复孔，每个96孔板设6个调零孔(加入100 μl含10%胎牛血清的1640培养基，不含脾细胞及刺激蛋白)。置于37 ℃含5% CO2的培养箱中培养72 h，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，放入37 ℃含5%CO2培养箱中培养4 h。取出，用孔板离心机离心2000 r/min，4 ℃，10 min，收取上清-70 ℃保存。每孔加入150 μl DMSO，手摇孔板，待结晶全部溶解，用酶标仪在492 nm处测定各孔的吸光度(OD)值。各刺激抗原脾细胞增殖率=(各刺激抗原OD平均值-调零孔OD平均值)/(对照孔OD平均值-调零孔OD平均值)。

1.4 ELISA法检测细胞培养上清及脑组织匀浆中的IL-4和IFN-γ水平取小鼠左侧半球脑组织，按湿重1：10加入0.2 M PBS，用超声波细胞粉碎机(Xinyi-ILD)匀浆，离心 10000 r/min，5 min，4 ℃，取上清分装-20 ℃保存。取脑组织匀浆及脾细胞培养上清，按照IL-4(Bender Med Systems@ BMS613)、IFN-γ(Bender Med Systems@ BMS006)试剂盒说明书操作。采用酶标仪(Elx800，BIOTEK)于450 nm处测定吸光度值(OD)，根据标准曲线计算出各样本IL-4、IFN-γ的浓度。

1.5 免疫组化法检测脑内星形胶质细胞及淋巴细胞浸润石蜡包埋的大脑右侧半球，按冠状位切片，厚约4 μm，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；3%双氧水37 ℃孵育10 min以阻断灭活内源性过氧化物酶，PBS冲洗3次，每次5 min；置0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH 6.0)中煮沸5 min以抗原修复，冷却至室温，PBS冲洗3次，每次5 min；正常羊血清工作液封闭，37 ℃，10 min，倾去勿洗；检测星形胶质细胞滴加兔抗小鼠GFAP 抗体(1∶200)，检测淋巴细胞浸润滴加兔抗小鼠CD3，CD5，CD45(1∶200)，4 ℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3次，每次5 min；滴加生物素标记相应的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min；DAB显色，自来水充分冲洗；苏木素复染5 min，常规脱水，透明，干燥，中性树胶封片。应用Polymer双染检测试剂盒(Zhongshan Golden bridge Biotechnology，China)对小鼠脑内星形胶质细胞与Aβ沉积进行双重标记。一抗为小鼠抗Aβ抗体(1∶200)和抗GFAP(1∶200)混合物，二抗为生物素标记的二抗混合物。图像分析应用MetaMorph显微图像分析系统，计算GFAP阳性细胞所占面积百分比。

2 结果

2.1 脾淋巴细胞增殖反应各组小鼠的脾细胞分别用Aβ3-10肽，Aβ1-42肽及ConA刺激，用MTT法检测体外脾细胞增殖率。加入刺激物培养72 h后，ConA在各组中都产生最高水平的增殖率，组间没有显著差异(P>0.05)；Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组在Aβ3-10肽及Aβ1-42肽刺激孔产生较高水平的增殖率，高于非相应免疫原刺激孔(P<0.05)，但低于ConA刺激孔产生的增殖率(P<0.05)；Ad-Aβ(3-10)10-CpG组在Aβ3-10肽刺激孔产生的增殖率和Aβ1-42组Aβ1-42肽刺激孔的增值率无显著差异(P>0.05)(见图1)。

2.2 脾细胞培养上清及脑组织匀浆中IL-4、IFN-γ水平检测 ConA刺激孔在各组中可检测到非常高水平的IL-4、IFN-γ，对于IL-4各组间比较无差异(P>0.05)。Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组当分别给予其相对应抗原刺激时检测到较高水平的IL-4、IFN-γ，但都明显低于ConA刺激产生IL-4、IFN-γ水平(P<0.01)。Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组分别在Aβ3-10肽和Aβ1-42肽刺激孔的IL-4水平无显著差异(P>0.05)。Aβ1-42组在Aβ1-42肽刺激孔的IFN-γ水平显著高于Ad-Aβ(3-10)10-CpG组在Aβ3-10肽刺激孔的IFN-γ水平(P<0.05)。空腺病毒载体组在Aβ3-10肽和Aβ1-42肽刺激孔都产生较低水平的IL-4、IFN-γ。Ad-Aβ(3-10)10-CpG组脑组织匀浆IL-4水平大于Aβ1-42组，但没有显著性差异(P>0.05)，Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组脑组织匀浆IL-4水平大于空腺病毒载体组(P<0.05)，Ad-Aβ(3-10)10-CpG组脑组织匀浆IFN-γ水平大于空腺病毒载体组(P<0.05)小于Aβ1-42组(P<0.05)(见图2)。

2.3 免疫治疗后APPswe/PSEN1dE9鼠脑内星形胶质细胞在每张抗GFAP单染片子的皮质及海马区各采集4张400倍图像，采用MetaMorph显微图像分析系统，计算GFAP阳性细胞所占面积百分比，Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和空腺病毒载体组相比皮质和海马区GFAP阳性细胞所占面积百分比为分别减少28.5%和24.1%(P<0.05)。Aβ1-42组和空腺病毒载体组相比皮质和海马区GFAP阳性细胞所占面积百分比为分别减少17.5%和19.3%(P<0.05)(见图3)。双染显示GFAP阳性细胞呈深蓝色、Aβ沉积呈深棕色，GFAP阳性细胞数量及被激活的形态随着Aβ沉积数量改变而改变，GFAP阳性细胞分布于Aβ沉积的周围及内部，对Aβ沉积呈现明显的趋向聚集现象。空腺病毒载体组：皮质及海马区GFAP阳性细胞密集分布，呈深棕褐色，胞浆明显增大，突触增多，皮质区多于海马区，GFAP阳性细胞密集分布于老年斑周围及内部；Aβ1-42组：GFAP阳性细胞形态上与空腺病毒载体组相比较，胞浆变小，突触变少，稀疏分布于老年斑周围及内部；Ad-Aβ(3-10)10-CpG组：GFAP阳性细胞，形态上胞浆更小，突触更少，零星分布于淡红色颗粒状老年斑周围及内部(见图4)。

2.4 脑组织内淋巴细胞浸润检测免疫后各组小鼠脑组织用免疫组化法检测CD3，CD5和CD45阳性淋巴细胞。三组小鼠血管内和脑实质可以偶尔发现少量CD3，CD5阳性细胞，三组小鼠均未观察到CD45阳性细胞。三组小鼠免疫组化结果未见明显差异(见图5)。

图1 体外脾T淋巴细胞增殖率。Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组在相对应抗原刺激时产生较高水平的增殖率，*与空腺病毒载体组比较P<0.05，#与Aβ1-42组比较P>0.05

3 讨论

研究表明小鼠和人的Aβ分子的B细胞抗原决定簇定位在Aβ1-15，T细胞抗原决定簇定位在Aβ的中间区域和C末端[6]。本研究用编码10次重复N末端片段Aβ3-10和CpG序列的新型腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG鼻粘膜免疫AD转基因鼠，通过MTT法检测体外脾T淋巴细胞增殖反应来观察Ad-Aβ(3-10)10-CpG引起的免疫反应只针对Aβ的B细胞抗原决定簇还是Aβ全肽段。脾T淋巴细胞增殖反应结果显示：只有当Ad-Aβ(3-10)10-CpG组给予Aβ3-10刺激时能产生较高的增殖率，提示Ad-Aβ(3-10)10-CpG引起了针对Aβ的B细胞抗原决定簇(Aβ3-10)，而不是Aβ全肽段的免疫应答。这样可以避免T细胞抗原决定簇特异性的细胞免疫应答引起的炎症反应。近期研究也发现编码Aβ3-10的质粒疫苗也能引起针对Aβ的B细胞抗原决定簇的免疫应答[7]，同时减少脑内炎症反应。

CD4+T辅助细胞可以分为五种功能性亚群，分别为Th1，Th2，Th3，Th7和调节性T细胞(Tregs)[8]，其中Th1和Th2是两个重要的功能性亚群。Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ等因子，Th1介导细胞免疫、细胞毒性T细胞和巨噬细胞活化；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-8等因子，Th2介导体液免疫、B细胞和嗜酸性粒细胞活化。其中IL-4、IFN-γ是判断Th细胞类型的主要细胞因子[9]，因此通过检测细胞因子，可以判断免疫所刺激的Th细胞类型。在脾细胞培养上清中，Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组在相应抗原刺激时分泌较多的IL-4、IFN-γ，Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组IL-4水平差别不明显，说明两组诱导的Th2反应相当，但Aβ1-42组IFN-γ水平明显高于Ad-Aβ(3-10)10-CpG组，说明Aβ1-42诱导了明显的Th1反应。Aβ1-42组脑组织匀浆中IFN-γ水平明显高于Ad-Aβ(3-10)10-CpG组，说明Aβ1-42上调了与炎症反应有关的IFN-γ释放。细胞因子检测结果提示：Ad-Aβ(3-10)10-CpG比Aβ1-42多肽疫苗减少了诱导与神经系统炎症有关的Th1免疫应答的趋势。

免疫后三组小鼠血管内和脑实质可以偶尔发现少量CD3，CD5阳性细胞，三组小鼠均未观察到CD45阳性细胞。这与AD患者接受Aβ1-42疫苗后发生脑膜脑炎的病理改变不同[1]。这与以往的研究结果相似[7，10]。说明Ad-Aβ(3-10)10-CpG鼻粘膜免疫没有引起脑膜脑炎的潜在危险。

在AD患者脑组织中，Aβ斑块周围有明显的星形胶质细胞活化，APPswe/PSEN1dE9双转基因鼠脑内星形胶质细胞聚集与Aβ沉积明显相关。星形胶质细胞可以产生炎性因子，促进Aβ聚集和纤维化转化[11]。研究表明，星形胶质细胞可以内化和降解Aβ，超微结构观察发现星形胶质细胞通过延长突起将神经元和纤维化Aβ分离，将Aβ内吞至内体/溶酶体[12]。进一步研究发现，Aβ聚集和被星形胶质细胞内吞通过改变神经元的代谢严重影响其活性[13]。在本研究中，GFAP阳性细胞所占面积百分比在Aβ1-42组及Ad-Aβ(3-10)10-CpG组明显减少，说明随着Aβ斑块的清除对胶质细胞的激活减少，Ad-Aβ(3-10)10-CpG可以下调对星形胶质细胞的激活，减少了胶质细胞活化对神经元的损害。

综上所述，腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG鼻粘膜免疫APPswe/ PSEN1dE9转基因鼠主要产生Th2型免疫应答，可以减少脑内星形胶质细胞活化，没有引起脑内炎症反应，避免了Aβ1-42全肽段所引起的炎症反应。基因重组腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG具有良好的安全性。

[1]Nicoll JA，Wilkinson D，Holmes C，et al. Neuropathology of human Alzheimer disease after immunization with amyloid-beta peptide：a case report[J]. Nat Med，2003，9(4)：448-452.

[2]Heppner FL，Ransohoff RM，Becher B. Immune attack：the role of inflammation in Alzheimer disease[J]. Nat Rev Neurosci，2015，16(6)：358-372.

[3]Boche D，Denham N，Holmes C，et al. Neuropathology after active Ab42 immunotherapy：implications for Alzheimer’s disease pathogenesis[J]. Acta Neuropathol，2010，120(3)：369-384.

[4]Li Y，Ma Y，Zong LX，et al. Intranasal inoculation with an adenovirus vaccine encoding ten repeats of Aβ3-10reduces AD-like pathology and cognitive impairment in Tg-APPswe/PSEN1dE9 mice[J]. J Neuroimmunol，2012，249(1/2)：16-26.

[5]李昱，张慧，林璐璐，等. Aβ3-10多价腺病毒疫苗鼻粘膜免疫AD转基因鼠的治疗效果研究[J]. 中风与神经疾病杂志，2017，34(1)：4-8.

[6]Cribbs DH，Ghochikyan A，Vasilevko V，et al. Adjuvant-dependent modulation of Th1 and Th2 responses to immunization with beta-amyloid[J]. Int Immunol，2003，15(4)：505-514.

[7]Xing XN，Sha S，Chen XH，et al. Active Immunization with DNA Vaccine Reduced Cerebral Inflammation and Improved Cognitive Ability in APP/PS1 Transgenic Mice by In Vivo Electroporation[J]. Neurochem Res，2015，40(5)：1032-1041.

[8]Halonen M，Lohman IC，Stern DA，et al. Th1/Th2 patterns and balance in cytokine production in the parents and infants of a large birth cohort[J]. J Immunol，2009，182(5)：3285-3293.

[9]Torres KC，Dutra WO，Gollob KJ，et al. Endogenous IL-4 and IFN-gamma are essential for expression of Th2，but not Th1 cytokine message during the early differentiation of human CD4+T helper cells[J]. Hum Immunol，2004，65(11)：1328-1335.

[10]Mouri A，Noda Y，Hara H，et al. Oral vaccination with a viral vector containing Abeta cDNA attenuates age related Abeta accumulation and memory deficits without causing inflammation in a mouse Alzheimer model[J]. FASEB J，2007，21(9)：2135-2148.

[11]Ruan L，Kang Z，Pei G，et al. Amyloid deposition and inflammation in APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer’s disease[J]. Curr Alzheimer Res，2009，6(6)：531-540.

[12]Wegiel J，Wang KC，Imaki H，et al. The role of microglial cells and astrocytes in fibrillar plaque evolution in transgenic APP(SW)mice[J]. Neurobiol Aging，2001，22(1)：49-61.

[13]Allaman I，Gavillet M，Bélanger M，et al. Amyloid-beta aggregates cause alterations of astrocytic metabolic phenotype：impact on neuronal viability[J]. J Neurosci，2010，30(9)：3326-3338.

Inflammatory response after intranasal inoculation with an adenovirus vaccine encoding multivalent Aβ3-10in Alzheimer’s disease transgenic mice

LIYu，SONGGuijun，LINLulu，etal.

(DepartmentofNeurology，TheSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity，Dalian116027，China)

Objective To study the inflammatory response after intranasal inoculation with a recombinant adenovirus vaccine Ad-Aβ(3-10)10-CpG in APPswe/PSEN1dE9 transgenic mice. Methods Eighteen ten-month old male APPswe/PSEN1dE9 mice were divided into three groups and immunized with recombinant adenovirus vaccine Ad-Aβ(3-10)10-CpG，empty adenoviral vector and Aβ1-42peptide，representatively. SpleenT-cell proliferation response was determined with MTT assay. Levels of IL-4 and INF-γ in spleen cell culture supernatant and brain homogenate were determined with ELISA. Astrocytes and CD3，CD5 and CD45 positive cells in the brain were detected with immunohistochemistry. Results Ad-Aβ(3-10)10-CpG group and Aβ1-42peptide group showed higher levels of proliferation rate restimulated with its corresponding antigen(P<0.05)，but lower than the ConA-stimulated wells(P<0.05). The percentage of area of GFAP positive cells in cortex and hippocampus was as follows：empty vector group>Aβ1-42peptide group>Ad-Aβ(3-10)10-CpG group. A very few CD5-positive and CD3-positive lymphocytes were occasionally observed within the blood vessels or in the parachyma in all three groups of mice. There were no significant different in all three groups. Ad-Aβ(3-10)10-CpG and Aβ1-42peptide group exhibited significantly greater IL-4 and IFN-γ levels in the cultures of spleen T cells restimulated with its corresponding antigen. Mice immunized with Aβ1-42peptide exhibited the greater IFN-γ levels in spleen T cells restimulated with Aβ1-42peptide than mice immunized with Ad-Aβ(3-10)10-CpG(restimulated with Aβ3-10)(P<0.05). IL-4 levels in brain homogenates from mice of Ad-Aβ(3-10)10-CpG group were greater than that of Aβ1-42peptide group，but the diffrence was not significant(P>0.05). IFN-γ levels in brain homogenates of Aβ1-42peptide group was greater than that of Ad-Aβ(3-10)10-CpG group(P<0.05). Conclusion Intranasal inoculation with a recombinant adenovirus vaccine Ad-Aβ(3-10)10-CpG appeared to induce a Th2 type immune response and reduction of astrocytosis without causing neuroinflammation in the brain. Ad-Aβ(3-10)10-CpG had low potential to cause autoimmune response caused by Aβ1-42peptide.

Alzheimer’s disease； β-amyloid； Inflammatory response； Astrocyte

图2 脾淋巴细胞培养上清及脑组织匀浆的IL-4/IFN-γ水平测定。(A)(B)脾细胞培养上清中IL-4/IFN-γ。(C)(D)脑组织匀浆中IL-4/IFN-γ。在相应抗原刺激时脾淋巴细胞培养上清有较高水平的IL-4(A)和 IFN-γ(B)。(A)*和空载体组比较P<0.05，#和Aβ1-42组比较P>0.05。(B)*和Ad-Aβ(3-10)10-CpG组与空载体组比较P<0.05，# 与空腺病毒载体组比较P<0.05。(C)*和空腺病毒载体组比较P<0.05，#和Aβ1-42组比较P>0.05。(D)* 和空腺病毒载体组比较P<0.05，# 和Aβ1-42组比较P<0.05

图3 免疫后各组小鼠GFAP阳性细胞分析。Ad-Aβ(3-10)10-CpG组(B1，B2)和Aβ1-42组(C1，C2)海马和皮质GFAP阳性细胞与空腺病毒载体组(A1，A2)相比明显减少。(D)海马和皮质GFAP阳性细胞所占面积百分比的定量分析，*和空腺病毒载体组相比P<0.05。比例尺代表 50μm