群体感应对铜绿假单胞菌感染过程的调控作用

赵净

摘 要 细菌群体感应（Quorum sensing， QS）是在细菌性病原体中广泛存在的细胞通讯方式。细菌的密度达到阈值时，将通过群体感应来协调生理过程，包括多种毒力因子的产生，生物被膜的形成及运动能力等。已有研究表明，在动物及人类细菌感染过程中，QS可增强致病菌的感染毒力。本文整合了动物体外及体内实验，也包括一些临床研究，针对性地介绍了铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的群体感应系统，综述了其群体感应系统与感染性疾病相关的研究。

关键词 感染 群体感应 铜绿假单胞菌

中图分类号：Q935 文献标识码：A

细菌群体感应（Quorum sensing， QS）是细菌细胞间的交流过程，细菌可分泌自诱导物（Autoinducer， AI），作为种内及种间交流的信号分子，相应的受体蛋白结合并感知信号分子，进而调节自身菌体密度及毒力基因的表达。QS是细菌适应环境变化并作出应激反应的重要通路，多种重要的致病细菌都利用QS系统来协调毒力因子的产生、生物被膜的形成及swarming运动等行为。近来研究发现，许多细菌的致病力与QS系统密切相关。在致病细菌中， QS调控的基因编码不同的毒力因子，如蛋白酶，毒素类物质及粘附素等。当细菌密度达到阈值，群体感应通路启动，细菌将会释放毒力物质，协同攻击宿主免疫系统，增大感染几率，利于感染的扩散。本文介绍了导致医院内感染的一种主要致病菌--铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的群体感应系统，讨论了细菌群体感应与其感染能力的关系。

1铜绿假单胞菌及其群体感应系统

铜绿假单胞菌是临床上常见的革兰氏阴性机会致病菌，拥有三套主要的群体感应系统，其中两种由酰基高丝氨酸内酯（N-acyl homoserine lactones ，HSL）信号分子介导，另外一种由喹诺酮类信号分子介导。Las系统由LasI合成酶合成信号分子3-oxo-C12-homoserine lactone （3-oxo-C12-HSL）。信号分子结合于受体蛋白LasR，形成二聚物，结合于包含las读码框的启动子，开启相关基因的表达。Rhl系统RhlI合成酶合成信号分子N-butyryl-L-homoserine lactone，结合于RhlR受体蛋白，调节下游基因表达。第三套群体感应系统由喹诺酮（2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone）信号分子介导。pqsABCDEH基因合成信号分子，喹诺酮信号分子结合于PqsR受体蛋白。

P. aeruginosa的三套群体感应系统彼此相互调节。Las系统首先被激活，进而调节Rhl及PQS系统，PQS系统激活Rhl系统，而Rhl系统却抑制PQS系统。另外，Las系统信号分子3-oxo-C12-HSL可功能性地结合于RhlR蛋白调节器，促进其裂解及失活；Rhl系统还可以调控吩嗪绿脓菌素的产生，导致真核宿主细胞发生氧化性损伤，破坏宿主抗氧化防御系统；PQS系统可增强lasB弹性蛋白酶及绿脓菌素的生成。在细菌生长稳定期，RhlR可替代缺失的LasR，促进蛋白酶、绿脓菌素、PQS及3-oxo-C12-HSL的产生。因此，这三个群体感应系统对于P. aeruginosa毒力的调节作用是重叠而又复杂的。

2群体感应调控铜绿假单胞菌体内感染模型

已有多种动物模型被用于研究QS在P. aeruginosa致病过程中发挥的作用，典型的有线虫模型（Caenorhabditis elegans），果蝇模型（Drosophila melanogaster），斑马鱼模型（Danio rerio）及老鼠模型（Mus musculus）。实验中主要通过两种策略验证群体感应在感染过程中发挥的作用：（1）利用群体感应基因缺失突变株；（2）使用群体感应抑制剂（Quorum sensing inhibitor， QSI）。本文主要介绍线虫模型及小鼠模型。

2.1线虫体内感染模型

线虫模型被广泛应用于研究群体感应与P. aeruginosa致病毒力之间的联系， P. aeruginosa PA14可通过两种机制导致线虫死亡，一种是细菌在线虫肠内积累引发的感染导致的慢性死亡（Slow killing）；一种是QS调控产生的吩嗪类物质增加了线虫体内的活性氧，引发的急性死亡（Fast killing）。第三种线虫模型是致死性麻痹（Lethal paralysis）模型，这种作用是通过las及rhl系统相关基因表达产生的因子快速引发线虫肌肉麻痹导致的。LasR缺失突变株感染后，可降低28%-100%的致死性麻痹；RhlR缺失突变株可100%降低麻痹死亡率。线虫实验的第四种表型是红色死亡（Red death），特征是P. aeruginosa感染后在线虫肠部由PQS与Fe3+产生的红色沉淀，因此，模型中P. aeruginosa感染引起线虫的死亡是由喹诺酮群体感应系统介导的。Musthafa使用化合物2，5-piperazinedione可提高线虫66%的存活率，化合物与HSL信号分子竞争结合于LasR蛋白的氨基酸残基上，破坏了群体感应通路。

2.2小鼠体内感染模型

线虫属于无脊椎动物，没有复杂的免疫细胞及获得性免疫能力，因此，在脊椎动物模型上分析群体感应对于P. aeruginosa致病能力也十分重要。在小鼠体内，人们主要用三种模型确定了QS在P. aeruginosa感染过程中的作用。第一种模型是在小鼠背部进行烫伤感染，随后在伤口处感染铜绿假單胞菌，用野生型P. aeruginosa PA14进行烫伤感染，仅有10%存活率，而用pqsA缺失突变株感染，存活率可达75%，表明铜绿假单胞菌毒力主要由QS调控；小鼠烫伤感染后使用QSI--邻氨基苯甲酸类似物可抑制PQS信号分子的合成及PqsR介导的QS相关基因的表达，限制P. aeruginosa PA14在全身的扩散感染，降低小鼠死亡率。第二种是新生小鼠肺部感染模型，lasR缺失突变株可明显降低细菌毒力，使肺部组织中的细菌无法增殖，控制了感染的扩散。第三种是小鼠体内异物感染模型，通过向小鼠腹腔内植入带有P. aeruginosa的硅胶片造成感染，在植入感染7天后，硅胶片上的lasR- rhlR双缺失菌株已被机体清除，而野生型P. aeruginosa PAO1可在硅胶片上定殖14-21天。另外小鼠植入感染后，腹腔注射QSI呋喃酮C30，可以有效提升细菌清除率。

3铜绿假单胞菌群体感应与人体感染

研究人员从人体感染的临床菌株中分离得到的大多数P. aeruginosa均利用群体感应系统，这也凸显了群体感应系统在调控P. aeruginosa感染人体时的重要性。

Feltner JB 等人从囊胞性纤维症病人体内分离得到2000余株铜绿假单胞菌，其中绝大多数的菌株中存在HSL介导的群体感应通路，可以分泌高浓度的HSL信号分子和由lasA及lasB基因表达产生的弹性蛋白酶；Garc€韆-Contreras R等人从囊胞性纤维症病人体内分离得50株铜绿假单胞菌，这些菌株产生的弹性蛋白酶、鼠李糖脂、氰化氢及绿脓菌素等毒力因子均可被群体感应抑制剂C30抑制，也说明群体感应对P. aeruginosa致病能力有调控作用。综合以上这些独立实验，分离得到的绝大多数临床感染铜绿假单胞菌都受HSL群体感应调控。

尽管P. aeruginosa感染是由多种因素造成的，但群体感应调控细菌向胞外分泌信号分子及毒力因子与细菌致病力密切相关。很多从囊性纤维病人痰液样本中分离的P. aeruginosa均可分泌N-（3-oxododecanoyl）-HSL信号分子，除了作为细菌间的交流信号，还可抑制宿主淋巴细胞的增殖以及T淋巴细胞对 -肿瘤坏死因子、 -干扰素的分泌；QS调控分泌的碱性蛋白酶可与凝集素介导的补体激活通路，阻止吞噬细胞及中性粒细胞对细菌的清除作用；彈性蛋白酶通过破坏人体凝血酶，抑制宿主启动炎性反应，导致免疫逃逸；鼠李糖脂能够破坏钙调节途径和蛋白激酶C活化，防止在人体角质细胞中形成 -防御素-2；多糖藻酸盐可以保护铜绿假单胞菌生物被膜细胞不被IFN- 介导的巨噬细胞杀死；P. aeruginosa中这些由QS调控产生的毒力因子在细菌感染过程中，对细菌本身及宿主免疫系统均发挥着不可或缺的作用。

4小结与展望

体外及体内研究结果显示，群体感应系统调控铜绿假单胞菌的毒力，在其致病过程中发挥重要作用。这启发我们，在不抑制细菌生长的前提下，阻断致病菌群体感应通路，既不给细菌造成生长压力，又可降低细菌感染能力，可避免传统抗感染治疗的弊端，是治疗细菌感染的新手段。

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