瓜氨酸对盲肠结扎穿孔脓毒症大鼠心脏的保护作用机制研究

罗玉龙　周吉秋　武楠　黄伟　张森

【中圖分类号】R364.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2017）05-0-01

脓毒症伴发心肌损伤造成心脏功能障碍是脓毒症患者常见的死亡原因之一，预防和控制脓毒症患者心肌损伤可有效降低脓毒症患者的死亡率。目前认为脓毒症造成心脏损伤的主要原因包括炎症细胞因子的浸润，氧化应激损伤等。瓜氨酸，一种不存在于蛋白质中的L-a-氨基酸能促进精氨酸进入内皮细胞和免疫细胞，在一定程度上提升精氨酸的作用，可通过负反馈调节NO的生成，同时瓜氨酸还具扩张血管、降血压、抑制血管内皮细胞增殖等作用。本研究拟通过盲肠结扎穿孔模型，通过补充瓜氨酸，探讨其对脓毒症大鼠心脏的组织病理变化、心肌酶水平和抗氧化能力的变化，为脓毒症心肌损伤的预防及治疗提供新思路。

1.材料和方法

1.1 主要材料和仪器 瓜氨酸（合肥博美生物科技有限责任公司），蛋白定量测试盒、总超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合成酶（NOS）测试盒（南京建成生物研究所），生化自动分析仪。

1.2 实验动物和分组 无特定病原体级健康雄性Wistar大鼠，体重250～300g，7～10周龄。大鼠按随机数表法分六组：正常空白对照组（Normal）、假手术组（sham）、脓毒症组（CLP）、瓜氨酸治疗组（CLP+Cit），各组8只大鼠。

1.3 动物模型制备 Wister大鼠称重、编号。Normal组不做特殊处理；sham组麻醉开腹，略微翻动盲肠后缝合关腹；CLP组行CLP术，麻醉后沿腹中线做一条长约2cm切口，于盲肠中段部位4.0丝线结扎打结，21号无菌针头贯穿肠管，挤压盲肠末端让粪便内容扩散到腹膜后关腹；CLP+Cit组术前瓜氨酸灌胃给药7d，剂量为200mg/kg·d-1，余操作同脓毒症组。

1.4 标本采集与处理 各大鼠于术后6h、12h麻醉后经腹主动脉取血5ml，待血清析出后3000r/min离心15min，取上清-80℃保存备测。取血后处死大鼠，摘除大鼠心脏放入4℃生理盐水中漂洗，去除包膜及血管，取各组大鼠少量心肌组织以10%福尔马林固定，石蜡包埋切片，HE染色后光镜下观察心肌组织病理变化，余下心脏标本-80℃保存备测。

1.5 大鼠血生化检测 取大鼠1ml血清，全自动生化分析仪检测血清肌酸激酶CK、肌酸激酶同工酶CK-MB、乳酸脱氢酶LDH、a-羟丁酸脱氢酶的水平HBDH；南京建成生物工程研究所的NO测定试剂盒和NOS分型测定试剂盒测定各组大鼠血清NO含量及iNOS活力；

1.6 大鼠心脏组织SOD、MDA的测定 取大鼠心脏组织100mg，制备成10%的组织匀浆，取上清得到组织匀浆液，考马斯亮蓝法进行蛋白定量测定，采用南京建成生物工程研究所的SOD、MDA试剂盒测定心脏组织匀浆液中SOD、MDA水平。

1.7 统计学方法 采用spss17.0软件包对研究数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料采用均值±标准差（±s）的形式进行描述，计量资料组间比较采用单因素方差分析进行，所有检验以双侧Ρ<0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 大鼠心脏组织病理学（HE×400）

光镜下，HE染色可见Normal组大鼠心肌横纹肌纤维（×400倍）结构清晰，肌纤维核呈卵圆形，位于细胞中央；CLP组大鼠心肌纤维间被炎性细胞浸润，心肌细胞变细，心肌间质水肿；CLP+Cit组大鼠心肌纤维间炎性细胞浸润较CLP组轻，心肌细胞大小变化不大，心肌间有渗出现象。

2.2 大鼠心肌酶检测

在术后6h，12h两个时间点，CLP组大鼠血清CK、HBDH及NO显著高于CLP+Cit组（P<0.05），而CLP组与CLP+Cit组血清LDH、iNOS差别不大（P>0.05）。

2.3 大鼠心脏组织SOD、MDA的测定

在实行CLP造模术后，CLP+Cit12h亚组大鼠心脏组织中SOD的活力值均高于CLP组相对应的亚组（P<0.05）；而CLP12h亚组大鼠心脏组织中MDA的水平均高于CLP+Cit相对应的亚组（P<0.05）。

3.讨论

脓毒症初期，机体启动快速防御机制清除病原体，外周血中性粒细胞数目增多，吞噬性增强，血小板的数目增多，粘附与聚集性加强。另外，脓毒症所产生释放的炎症因子对组织脏器细胞可通过直接造成脏器损伤。最后，在内毒素及炎症细胞因子的作用下，iNOS的活力增加，诱导生成更多的NO，加重炎症反应。我们在前期研究中发现补充瓜氨酸能缓解早期脓毒症促炎细胞因子的释放，并增加机体后期抗炎细胞因子的释放，缓解脓毒症大鼠炎症反应。

研究结果显示，补充外源性瓜氨酸后，病理损害减轻，血清NO浓度下降，CLP+Cit组的血清CK、LDH、HBDB也均低于CLP组，提示瓜氨酸可降低血清中CK、CK-MB、LDH、HBDH、NO水平，提高心脏抗氧化能力，减轻脓毒症对心脏组织的损害。其作用机制可能与瓜氨酸作为精氨酸的合成前体，一方面促进了精氨酸的合成，提升了精氨酸的作用，造成NO的生成增多，导致炎症细胞因子的生成减少，改善了大鼠的缺血缺氧的病态；另一方面瓜氨酸可通过“Cit-NO”循环，拮抗NO大量生成，避免了NO蓄积所造成负反应对大鼠的损害；但具体的作用机制还有待继续深入的研究。

参考文献

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[2] Li S， Jiao X， Tao L， et al. Tumor necrosis factor-alpha in mechanic trauma plasma mediates cardiomyocyte apoptosis[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol， 2007， 293（3）： H1847-1852.