生防菌PFMP-5对蔬菜根结线虫的毒杀效果及其鉴定

丁磊，徐玉梅，王建明

(山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

生防菌PFMP-5对蔬菜根结线虫的毒杀效果及其鉴定

丁磊，徐玉梅，王建明

(山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

[目的]对蔬菜根结线虫病进行生物防治是绿色、安全无污染的有效途径，为获得对根结线虫有明显拮抗作用的生防细菌，[方法]采用土壤平板梯度稀释法对根结线虫有良好防效的细菌菌株PFMP-5。并通过形态特征观察、生理生化测定以及16S rDNA序列分析并确定该菌株的分类地位；[结果]结果表明：PFMP-5菌株为沙雷氏菌属嗜线虫沙雷氏菌Serratianematodlphila。生防细菌PFMP-5对根结线虫有明显的抑制作用，该菌150倍液在48小时后对根结线虫的抑制率仍在45%以上。[结论]PFM-5是一株极具开发潜力的生防菌株。

生物防治； 根结线虫； 鉴定； 毒杀效果

根结线虫(Meloidogyne)是一类世界性分布的植物病原线虫，全球每年因根结线虫造成的经济损失达1000亿美元[1]，据不完全统计，仅蔬菜上每年因根结线虫病造成的损失就超过50亿元，受害严重的保护地甚至毁棚或绝收[2～5]。根结线虫病害因其发病初期症状很难辨别，一旦地上叶片呈现症状时就已经病入膏肓。再加上根结线虫寄生性强、寄主范围广、繁育周期短和繁殖频率高等原因都给其防治加了难度[6,7]。

目前生产上常用化学防治结合农业防治进行根结线虫的防治，但是农业防治收效慢，适应于大面积推广。而常用的杀线虫剂因其高毒性、高残留、破坏土壤结构等原因而逐渐被禁限用。随着人们环保意识的增强，可替代使用的生物杀线剂现在已被逐渐引入到根结线虫的防治中[8～10]，尤其对于生产有机绿色无公害的餐桌蔬菜而言更是具有广阔的应用前景。但是目前登记的生防产品仅有厚孢轮枝菌、淡紫拟青霉和阿维菌素，可供选择的药剂单一，无轮换药剂选择，而且长期使用单一杀线虫剂会导致不同程度的抗药性。

本课题组在前期研究根结线虫生防菌荧光假单胞菌过程中，在其代谢产物中发现一株能产红色色素的菌株PFMP-5，经初步测试其对根结线虫有较好的防治效果，为了进一步探究PFMP-5生物学特性及其在根结线虫生防中的作用机理，本研究对菌株PFMP-5对根结线虫的室内毒杀效果测定，并采用形态特征、生理生化特性以及分子生物学相结合的方法对其进行鉴定，为其后续对其进一步开发利用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

生防菌PFMP-5是从根结线虫生防菌荧光假单胞菌X-20菌株代谢产物分离获得的，将PFMP-5菌株置于装有NA液体培养基的150 ml三角瓶中培养，恒温28 ℃，转速180 r·min-1，连续培养48 h，即获得其发酵液。采用血球计数器测得其浓度约为5.3×108cfu·ml-1。

1.2 供试线虫

在山西省晋中市太谷县郝村和范村发生根结线虫病的蔬菜大棚内，采集甜瓜植株根部的根结及其根围0～15 cm土层的土壤，装入自封袋带回实验室。分离时采用浅盘法对根部和土样中的根结线虫的二龄幼虫备用[11]。

1.3 生防菌PFMP-5对根结线虫的室内毒杀效果测定

吸取2 ml生防菌PFMP-5发酵液置于贝氏小皿中，挑入根结线虫二龄幼虫30头，放于28 ℃恒温培养箱中，在12 h、24 h和48 h后在体视镜下观察二龄幼虫的死活，以蒸馏水作为对照组，每组处理重复3次，以校正死亡率判断生防菌对根结线虫的毒杀效果。

校正死亡率=(处理某时刻线虫死亡率-对照某时刻死亡率)/(1-对照某时刻死亡率)×100%

1.4 生防菌PFMP-5的鉴定方法

1.4.1 形态学特征

用划线法将生防菌PFMP-5在NA培养基上培养12～24 h后，观察其在固体培养基上的菌落形态特征并进行拍照；参考方中达等[12]方法对其进行芽孢染色、鞭毛染色和革兰氏染色，观察染色结果并拍照记录。

1.4.2 生理生化特性测定

生理生化主要测定：明胶液化、赖氨酸脱羧酶、VP(二乙酰)反应、水解淀粉、蔗糖产酸、氧化酶、麦芽糖利用、精氨酸双水解酶、生长4 ℃、生长42 ℃、葡萄糖利用和果糖利用，具体方法参考方中达等[12]。

1.4.3 分子生物学鉴定

本试验采用细菌通用引物对7F/1540R和27F/1492R对该菌的16S rDNA进行PCR扩增，PCR反应体系为：10×Taq buffer 2.5μL，d NTPs (2.5 mmol·L-1) 1 μL，模板DNA(20 mg·L-1)0.5 μL，PCR引物各0.5 μL，Taq plus DNA polymerase 0.2 μL，加双蒸水补至25 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min，94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃修复延伸10 min，PCR产物保存于4 ℃冰箱备用。PCR产物与PMD19-T 载体(TaKaRa)连接，酶切鉴定正确后，送上海生工有限公司测序。测序结果通过在线分析(http://www.ncbi.nlm. nih.gov)，与 GenBank中的16S rDNA序列进行同源性分析，并用MEGA 5.0构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 生防菌PFMP-5对根结线虫的室内毒杀效果测定

不同浓度的生防菌PFMP-5发酵液对根结线虫的室内毒杀效果如表1所示，原液、稀释5倍和稀释10倍的发酵液杀线虫率逐渐下降，12 h杀线率依次为100%、82.14%±2.38%和60.71%±2.38%。48 h的不同浓度发酵液杀线虫率仍为逐渐下降，相较于对应浓度的24h杀线虫率都有所上升，对根结线虫的毒杀效果依次为100%、90.12%±1.64%和62.96%±2.47%。将生防细菌PFMP-5发酵液进一步稀释到20倍、50倍、100倍、150倍、200倍，并进行杀线虫能力测试，结果显示，随着生防细菌PFMP-5发酵液浓度的降低，其杀线虫率也有所下降，但直到稀释液浓度达到150倍时，48 h后根结线虫校正死亡率仍可达到40%以上。

2.2 根结线虫生防菌PFMP-5形态学特征

将生防细菌PFMP-5在NA培养基上培养12～24 h观察其菌落形态特征，并对其进行芽孢染色、鞭毛染色和革兰氏染色，结果表明，生防细菌PFMP-5在NA固体培养基上单菌落呈红色圆形，周边整齐，表面隆起(如图1)；菌体呈不透明白色且非常活跃，移动速度快(如图2)；该菌革兰氏染色结果为阴性(如图3)。鞭毛染色结果显示其有1～2条单极生鞭毛或周身鞭毛(如图4)。芽孢染色结果显示其无芽孢(如图5所示，菌体为红色)。

表1 不同浓度PFMP-5发酵液对根结线虫的毒杀效果

Table 1 Toxic effects of PFMP-5 in different concentration on root-knot nematodes

浓度Concen⁃tration12h24h48h原液10000%±000%10000%±000%10000%±000%稀释5X8214%±238%9012%±164%9877%±164%稀释10X6071%±238%6296%±247%8395%±165%稀释20X5357%±238%6296%±247%7778%±247%稀释50X4524%±159%6790%±329%7531%±165%稀释100X4286%±238%5556%±000%6173%±164%稀释150X1548%±159%2099%±164%4568%±165%稀释200X357%±238%988%±164%3704%±000%

图1 生防细菌PFMP-5菌落形态Fig.1 The morphous of strain PFMP-5

图2 生防细菌PFMP-5单个菌株形态Fig.2 The morphous of single PFMP-5

图3 生防细菌PFMP-5菌株革兰氏染色结果Fig.3 The gram strain result of PFMP-5

图4 生防细菌PFMP-5菌株鞭毛染色结果Fig.4 The staining result of strain PFMP-5

图5 生防细菌PFMP-5菌株芽孢染色结果Fig.5 The spore straining result of PFMP-5

2.3 生防菌PFMP-5的生理生化特性

生防菌PFMP-5的部分生理生化特性如表2所示，其测定结果与相关文献中的结果完全吻合。

表2 生防细菌PFMP-5部分生理生化特性

Table 2 TabBiochemical and physiological characteristics of strain PFMP-5

生理生化特征Characterisitics菌株PFMP⁃5StrainPFMP⁃5嗜线虫沙雷氏菌[13]Serratianematodlphila明胶液化[13]++赖氨酸脱羧酶[13]--VP(二乙酰)反应[13]++水解淀粉[13]--蔗糖产酸[13]++氧化酶[14]--麦芽糖利用[13]++精氨酸双水解酶[15]--生长4℃--葡萄糖利用[16]++果糖利用++

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性

2.4 根结线虫生防菌PFMP-5的分子生物学

生防细菌PFMP-5 16S rDNA PCR扩增与测序结果如图5所示，生防细菌PFMP-5经过16S rDNA通用引物扩增后，获得长度约序列总长1 477 bp目的基因片段。

图5 生防菌PFMP-5 16S rDNA PCR 凝胶电泳扩增图Fig.5 Electrophoretogram of 16S rDNA PCR amplification for PFMP-5

将菌株PFMP-5所测的16S rDNA序列与其他细菌的16S rDNA序列进行比对，结果如图6显示，PFMP-5与嗜线虫沙雷氏菌(Serratianematodlphila)相似度最高，同源性为65%。

图6 PFMP-5系统发育树Fig.6 The phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain PFMP-5

2.5 根结线虫生防菌PFMP-5的综合鉴定结果

通过对PFMP-5菌株形态学、生理生化和16S rDNA等多项指标分析，确定分离菌株PFMP-5为嗜线虫沙雷氏菌(Serratianematodlphila)。

3 结论与讨论

经过对该细菌的形态、生理生化特性及分子鉴定，确定该细菌为嗜线虫沙雷氏菌(Serratianematodlphila)，隶属于变形菌门(Proteobacteria)，γ-变形菌纲(γ-proteobacteria)，肠杆菌目(Enterobacteriales)，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)沙雷氏菌属(Serratia)，为革兰氏阴性菌。同时也证明了嗜线虫沙雷氏菌对蔬菜根结线虫有良好的抑制杀灭作用。

此外，沙雷氏菌在医药卫生、环境保护、纺织染料方面具有广阔的应用前景和巨大研发价值，但是有关沙雷氏菌防治植物病害的报道仍然较少，尤其是沙雷氏菌的次生代谢产物灵菌红素，虽然其对于生产生活方面的作用和意义还不是彻底明了，但现在它已被发现具有多种生物活性作用，能抗癌，抗微生物，抗疟疾，抗霉，免疫抑制的作用[17,18]。其中抗癌方面，因为其具有癌组织的高针对性和对正常细胞则表现的低毒害作用，而成为一种非常有潜力的抗癌物质[19]。但要将其应用到植物根结线虫的防治中还需要进一步的探索和实践。

[1]Sikora R A, Fernàndez E. Nematode parasites of vegetables[M]. In: Luc,M., Sikora, R.A., Bridge, J. (Eds.), Plant Parasitic Nematodes in Subtropical and Tropical Agriculture. CAB International, Wallingford, UK, 2005: 319-392.

[2]SiddiquiZ A, AkhtarM S. Effects of AM fungi and organic fertilizers on the reproduction of the nematodeMeloidogyneincognitaand on the growth and water loss of tomato [J]. Biology and Fertility of Soils, 2007, 43 (5): 603-609.

[3]彭德良. 蔬菜病虫害的综合治理(十) 蔬菜线虫病害的发生和防治 [J]. 中国蔬菜,1998(4): 57-58.

[4]段玉玺.植物根结线虫病的防治 [M]. 北京: 中国农业科技出版社, 2002：102-103.

[5]Trudgill D L, Blok Apomictic V C. polyphagous root-knot nematodes: exceptionally successful and damaging biotrophic root pathogens [J]. Annual Review of Phytopathology, 2001, 39 (4): 53-77.

[6]Manzanilla-Lopez R H, Kenneth E, Bridge J. Plant diseases caused by nematodes[M]. In: Chen Z X, Chen S Y, Dickson D W (Eds.), Nematology Advances and Perspectives Nematode Management and Utilization Vol. II. CAB International, Wallingford, UK, 2004: 637-716.

[7]Trudgill D L, Blok V C. Apomictic, polyphagous root-knot nematodes: exceptionally successful and damaging biotrophic root pathogens[J]. Annu Rev Phytopathol.2001, 39: 53-77.

[8]Anastasiadis I A, Giannakou I O, Prophetou-Athanasiadou D A. The combined effect of the application of a biocontrol agentPaecilomyceslilacinus, with various practices for the control of root-knot nematodes. Crop Prot. 2008, 27: 352-361.

[9]Upadhyay R K, Mukerji K G, Chamola B P. Biocontrol Potential and Its Exploitation in Sustainable Agriculture[M]. Volume 1: Crop Diseases, Weeds, and Nematodes. Kluwer Academic/Plenum, New York, USA.2000.

[10]Zhang S, Gan Y, Xu B. Biocontrol potential of a native species of Trichoderma longibrachiatum against Meloidogyne incognita[J]. Appl. Soil Ecol, 2015,94: 21-29.

[11]Whitehead A G，Hemming J R. A comparison of some quantitative methods for extracting small vermiform nematodes from soil [J]. Annals of Applied Biology, 1965(55): 25-38.

[12]方中达.植病研究方法[M].北京:中国农业出版社,1998:203-211.

[13]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001:453-454.

[14]马蕾,王红英,钱斯日古楞.一株产胶原蛋白酶嗜虫沙雷氏菌的分离与鉴定[J].食品工业科技,2012(13):143-145.

[15]陈历水,刘松玲,倪军,等.1株来源于腐败肉制品的沙雷氏菌的分离鉴定与特性研究[J].中国食品学报,2014(10):235-240.

[16]郑朝成,王长林,付玲,等.一株产耐高温DNA酶和蛋白水解酶的沙雷氏菌FS14(Serratia sp.FS14)的分离与鉴定[J].微生物学通报,2011(2):228-236.

[17]Williamson N R, Fineran P C, Gristwood T, et al. Anticancer and immunosuppressive properties of bacterial prodiginines[J]. Future Microbiology, 2007, 2(6): 605-618.

[18]Fender J E, Bender C M, Stella N A, et al.Serratiamarcescensquinoprotein glucose dehydrogenase activity mediates medium acidification and inhibition of prodigiosin production by glucose [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78(17): 6225-6235.

[19]李洪波, 杜巍, 赵凯,等.灵菌红素研究进展[J].生物技术通讯,2011,22(1):139-142.

(编辑：张贵森)

Toxic effect and identification of biocontrol potential bacterium PFMP-5 on root knot nematodes

Ding Lei， Xu Yumei， Wang Jianming

(CollegeofAgronomy，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China)

[Objective]Biological agents had become a safe, rapid, and environmentally friendly approach to control root-knot nematodes. In order to get biocontrol bacteria with obvious antagonistic effects to root-knot nematodes, [Methods]our research adopted pour plate method and nematicidal bacterial fermentation method, got a bacterial strain PFMP-5 which had excellent preventing effects to root-knot nematodes in the end. [Results]Through morphological observation, physiological and biochemical test and 16S rDNA sequence analysis, strain PFMP-5 was identified to beSerratianematodlphila.After 48 hours, the inhibition rate of root knot nematode was still above 45%. [Conclusion]The strain PFMP-5 had a wide prospect for its significant inhibitory effect on root-knot nematodes.

Biocontrol， PFMP-5， Root-knot nematodes， Identification

2016-12-22

2017-01-16

丁磊(1991-)，男(汉)，山西隰县人，硕士，研究方向：线虫分类及综合治理

*通信作者：王建明，教授，博士生导师，Tel:0354-6289739; E-mail:jm.w@sohu.com.

山西省科技攻关项目(20120311019-3)；山西省应用基础研究计划项目(201601D202072)

S432.4

A

1671-8151(2017)05-0330-05