CK19对桥本甲状腺炎伴发多灶性甲状腺乳头状癌的预测价值

夏清 严沛元 谢小军 董帅

CK19对桥本甲状腺炎伴发多灶性甲状腺乳头状癌的预测价值

夏清 严沛元 谢小军 董帅

目的 探讨细胞角蛋白（CK19）对桥本甲状腺炎（HT）伴多灶性甲状腺乳头状癌（PTC）的预测指标。方法 根据病理检查结果选择HT合并多灶性PTC（A组）、HT合并单发PTC（B组）、单纯HT（C组）各30例，观察并分析其术前酶标免疫分析法测定的血清CK19水平及免疫组化方法检测的病理标本CK19表达情况。结果 A、B两组和B、C两组患者血清CK19表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。病理标本CK19免疫组化结果A组呈强阳性，B组呈阳性，C组呈弱阳性，组间比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。 结论 HT伴多灶性PTC患者CK19免疫组化阳性表达水平，明显高于HT伴单发PTC患者，对术前穿刺或术中标本CK19免疫组化呈强阳性表达者应考虑行甲状腺全切术。

细胞角蛋白19 桥本甲状腺炎 甲状腺乳头状癌

桥本甲状腺炎（hashimoto’s thyroiditis，HT）癌变问题是近年来临床研究的热点之一，有关发病的许多机制尚未明确，且治疗方案也仍存在争议。有学者主张对此类患者一律行甲状腺全切除术，但有研究表明甲状腺全切术后永久性甲状旁腺功能减低和喉返神经损伤的发生率较高[1]。因此，临床上一般认为HT伴单发小癌灶可行单侧腺叶切除术，但目前尚无明确指标能预先判断HT伴发的是单发癌还是多灶癌，如确定为HT伴多灶性甲状腺乳头状癌（PTC），应行甲状腺全切术。术前B超检查有一定的局限性，术中冷冻切片也只是把比较明显的结节进行快速病理检查，往往会遗漏微小癌灶，因此进行HT多灶性癌变预警信号的研究对指导临床治疗方案具有重要意义。研究证实，细胞角蛋白19（CK19）在所有的PTC中都表达，作为PTC标记的灵敏度达到100%，特异度达到82.15%[2]。典型PTC中CK19多呈强阳性表达，滤泡型乳头状癌与混合较多滤泡结构的PTC多呈中等或稍强阳性表达，直径＜1cm的隐匿性PTC及甲状腺内微小转移灶也呈弥漫性阳性表达，癌旁组织、腺瘤、结节性甲状腺肿及乳头状增生均呈阴性或小灶性阳性表达，提示CK19有助于PTC的诊断，可用于隐匿性PTC与良性结节的鉴别诊断及判断甲状腺组织内是否存在微小转移灶。但CK19在HT伴多灶性或单发PTC中的表达是否有差异，能否作为前者的预警信号尚未见报道，对此笔者进行了研究，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 根据术后病理检查结果，选取2013年6月至2015年6月在浙江省人民医院及浙江大学医学院附属第一医院手术治疗的HT伴多发性PTC（A组）、HT伴单发（B组）及单纯HT（C组）患者各30例。A组男6例，女24例，平均年龄（46.00±7.25）岁，＜45岁11例（占36.67%），≥45岁19例（占63.33%）；B组男8例，女22例，平均年龄（49.00±6.89）岁，＜45岁9例（占30.00%），≥45岁21例（占70.00%）；C组男10例，女20例，平均年龄（50.00±5.77）岁，＜45岁8例（占26.67%），≥45岁22例（占73.33%）。3组患者性别、年龄比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。纳入标准：所有因具备甲状腺手术指征行手术治疗而术后病理证实为HT伴PTC或单纯HT的患者。排除标准：有甲状腺功能亢进、亚急性甲状腺炎病史、结核病史或有其他恶性肿瘤病史、免疫功能低下、其他重大疾病史，术前曾行化疗、放疗或免疫治疗史的患者。所有患者均为体检彩超检查发现甲状腺结节因怀疑恶性或因结节较大有症状而行手术治疗，术前均采集血液样本进行化验，所有患者均经病理诊断证实。根据术后病理结果将其分为A组（HT合并多灶性PTC）、B组（HT合并单发PTC）、C组（单纯HT），每组30例。

1.2 主要试剂 CK19试剂盒购自美国RB公司；CK19抗体购自美国Santa Cruz Bio公司；DAB显色试剂盒（20×）购自北京CWbio公司；PBS（pH7.5，10×）购自北京CWbio公司；中性树胶购自北京CWbio公司；改良型苏木素购自北京CWbio公司；二甲苯购自北京化学试剂公司；无水乙醇购自北京化学试剂公司。

1.3 检测方法

1.3.1 血清CK19水平的测定 所有患者均术前禁食12h后采血，清晨空腹抽取肘静脉血3ml。室温下静置30min后，2 000r/min离心15min，分离血清，取1.5ml放置在-70℃冰箱保存备用，所有血清统一编号，各项指标均统一标准。实验采用双抗体夹心酶标免疫分析法测定血清CK19水平。先将微孔板用纯化的抗体包被，制成固相抗体，然后向包被单抗的微孔中按顺序加入CK19抗原、生物素化的抗人CK19抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素，彻底洗涤后用底物四甲基联苯胺（TMB）显色。在过氧化物酶的催化下，TMB转化为蓝色，最后在酸的作用下转化为黄色。颜色深浅与血清CK19浓度呈正相关。在450nm的波长下，用酶标仪测定吸光度（OD值），将标准物浓度作为横坐标（对数坐标），OD值作为纵坐标(普通坐标),然后在半对数坐标纸上画出标准曲线。由血清样本的OD值根据标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数，即为样本的实际浓度。

1.3.2 病理标本CK19免疫组化法检测 60℃烤片1h，二甲苯脱蜡2次，每次5min；二甲苯与纯乙醇（1∶1）混合2min，再按顺序浸入梯度乙醇（纯乙醇－纯乙醇－95%乙醇－85%乙醇－75%乙醇）及蒸馏水中，每次2min水化；用内源性过氧化物酶封闭10min，然后PBS洗净；用蛋白非特异性结合位点封闭10min，然后PBS洗净；用0.1%Triton在冰上孵育 15min，然后 PBS洗净；用0.125%胰酶在室温下孵育30min，然后PBS洗净；用冷0.1mol/L盐酸孵育30min除去染色体的组蛋白，然后PBS洗净；用2mol/L盐酸在室温下孵育35min，使DNA双链解开，然后PBS洗净；用0.1mol/L四硼酸钠在室温下孵育20min，然后PBS洗净；用一抗（鼠抗人CK19单克隆抗体）工作液孵育36h，然后PBS洗净；用二抗（羊抗鼠IgG）工作液孵育RT 30min，然后PBS洗净；用Streptavidin-HRP工作液孵育RT 30min，然后PBS洗净。DAB显色：采用DAB显色试剂盒（20×），用现配的DAB工作液显色2～7min，然后在显微镜下观察，控制显色时间。苏木素复染：采用改良型的苏木素，复染1～ 3min，然后PBS冲洗返蓝；用1%盐酸分化液分化10s，然后PBS冲洗返蓝。用75%－85%－95%－100%－100%各浓度乙醇每种3min逐级脱水，二甲苯与纯乙醇（1∶1）混合5min，用二甲苯浸没2次，每次5min，然后加中性树脂将盖玻片封片，晾干。最后用显微成像系统拍照，对比图像结果，染色强度以阳性细胞＜25%为+，阳性细胞25%～50%为++，阳性细胞51%～75%为+++，阳性细胞＞75%为++++；广泛深染（+++～++++）为强阳性，中度染色（+～++）为阳性，低度染色（＜+）为弱阳性。用国际通用的IPP（image pro plus）软件（美国Media Cybernetics）进行平均光密度定量分析。

1.4 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件，计量资料以表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析；计数资料组间比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 3组患者血清CK19表达水平的比较 CK19表达水平以HT合并多灶性PTC组为高，HT合并单发PTC组居中，单纯HT组低，但3组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 3组患者血清CK19表达水平的比较（ng/ml）

2.2 3组标本CK19免疫组化检测结果

2.2.1 3组标本镜下所见 免疫组化检测结果显示A组CK19表达呈强阳性（+++～++++），B组CK19表达呈阳性（+～++），C组CK19表达呈弱阳性（＜+），见图1。

图1 3组标本CK19免疫组化检查结果（SP法×40）

2.2.2 3组标本平均光密度定量分析结果比较 C组密度最低，与A、B组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。A组平均光密度明显高于B组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 3组标本平均光密度定量分析结果比较

2.3 CK19表达水平与PTC淋巴结转移的关系 A、B两组CK19阳性表达比较差异有统计学意义（P＜0.05）。在颈部中央区淋巴结转移阳性的患者中CK19免疫组化强阳性表达比例明显高于转移阴性的患者，差异有统计学意义（P＜0.05），但在单独A或B组中差异均无统计学意义（均P＞0.05），血清CK19水平差异亦无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 CK19表达水平与甲状腺乳头状癌淋巴结转移的关系[例（%）]

3 讨论

HT伴发甲状腺癌主要是PTC，且往往为多灶性PTC。近年来HT伴发PTC的发病率呈明显上升趋势。研究表明，HT伴发TC的发生率为12%，绝大多数为PTC，HT与PTC的发生关系密切[3-5]，HT伴有甲状腺功能减退的甲状腺结节，其恶变的可能性会大大增加。HT伴发PTC应手术治疗，但目前对手术范围的意见尚不一致，国外有些学者认为HT是癌前病变，患侧切除后，对侧腺体有2%～9%的概率会出现甲状腺癌复发，所以他们主张行甲状腺全切术；但也有学者提出，甲状腺全切术后出现的永久性甲状旁腺功能减低及喉返神经损伤的发生率较单侧切除术明显要高[6]。HT伴单发的小癌灶可行单侧腺叶切除术，如确定HT伴发多灶性PTC则应行甲状腺全切术，但目前尚无明确指标能预先判断HT伴发的是单发癌灶还是多灶癌。多发病灶是甲状腺癌、尤其是PTC的临床特征之一。多灶性PTC与淋巴结转移、远处转移及局部复发相关，多发癌灶可增加淋巴转移、远处转移及术后复发的风险[7]，本研究也表明多灶癌的淋巴转移阳性率明显高于单发癌。但目前对于多灶性PTC的诊断，只有在术中或术后经病理切片证实，而术中冰冻切片只是针对较为明显的结节，往往会遗漏其它微小癌灶。但如果都把双侧甲状腺全部切除进行病理检查则会使许多单发癌患者接受了过度治疗，且增加了手术并发症的发生率。因此，如能结合术前或术中检查对多灶性PTC进行预判将有助于选择手术方式，对指导临床治疗方案具有重要意义。

CK属于中微丝蛋白家族,是上皮细胞骨架的组成部分,在正常上皮、上皮源性原发肿瘤及其转移瘤细胞上表达。CK19分子量为40kD，其分子量较低，由KRT19基因编码，主要表达于正常上皮及各种上皮来源的肿瘤中，尤其是单层上皮和间皮；成人皮肤、肝细胞及角膜表达阴性，而子宫上皮、羊膜上皮及间质则呈阳性表达，主要用于腺癌的诊断。近年来，CK19在甲状腺疾病的研究中被广泛采用，国内外均有许多研究。CK19是目前常用的PTC诊断免疫标志物之一，其弥漫强阳性表达有助于PTC的诊断，可用于隐匿性PTC与良性结节的鉴别诊断及判断甲状腺内是否存在微小转移灶。Liu等[8]发现，CK19的高表达能提高PTC诊断的特异性。HT中淋巴滤泡周围甲状腺滤泡上皮有阳性表达，癌变组织中的阳性率为100%，且强而广泛。有研究发现，HT滤泡上皮增生、不典型增生、癌变，CK19的阳性表达会逐渐增强，CK19在HT中的高表达，特别是在不典型增生细胞中的高表达，提示其有可能发展为PTC，可作为早期检测HT向PTC癌变的指标之一[9]。Cochand-Priollet等[10]发现，与形态学方法相比，CK19抗体染色能够减少PTC诊断的假阳性率和假阴性率，从而提高诊断的准确性，减少不必要的手术治疗。另外在PTC患者当中,伴有淋巴结转移的患者CK19表达水平又高于没有淋巴结转移的。本研究结果表明，检测血清CK19水平因各组无统计学差异故认为其对预测是否为HT伴多灶癌没有帮助，对预测是否有淋巴结转移亦无帮助，而CK19免疫组化检测则有助于预测是否为HT伴多灶性PTC，而且对预测PTC淋巴结转移也具有一定的意义。本研究表明，HT伴多灶性PTC组CK19免疫组化呈强阳性表达，明显高于HT伴单发PTC组，故可作为预测HT伴多灶性PTC的指标，如术前穿刺或术中标本进行CK19免疫组化检测呈强阳性表达则提示很有可能为HT伴多灶性PTC，结合术中冷冻切片建议行甲状腺全切；另外颈部中央区淋巴结转移阳性组的CK19强阳性表达（+++～++++）率明显高于淋巴结转移阴性组，而淋巴结转移阳性组的CK19阳性（+～++）表达率则明显低于淋巴结转移阴性组，提示如CK19强阳性表达则很有可能中央区淋巴结转移为阳性，须行淋巴结清扫。

总之，HT与PTC的发生有非常密切的关系，而是否为多灶癌则直接关系到手术方式及预后。本研究发现HT伴多灶性PTC的组织中CK19呈强阳性表达，明显高于HT伴单发PTC，因此可以利用免疫组化检测CK19水平来预测是否为HT多灶性癌变，对于HT伴PTC的临床诊断治疗具有重要的指导作用。

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Predicting value of CK19 in Hashimoto's thyroiditis patients complicated w ith multifocal papillary thyroid carcinoma

XIA Qing,YAN

Peiyuan,XIE Xiaojun,et al.Department of Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou 310014,China

Objective To investigate the serum level and tissue exp ression of CK19 in Hashimoto's thyroid itis(HT) com p licated w ith multifocal pap illary thyroid carcinoma(PTC). Methods Ninety patients pathologically d iagnosed as HT w ith multifocalPTC(g roup A,n=30),HTw ith unifocalPTC(g roup B,n=30)and HT only(group C,n=30)adm itted in two hospitals from June 2013 to June 2015 were enrolled in the study.The CK19 levels in serum were determ ined by ELISA and the exp ression of CK19 in tissue sections was detected by immunohistochem istry. Results There was no significant d ifference in serum CK19 levels between g roups A and B,between g roups B and C(P＞0.05).The exp ression ofCK19 in tissue specimens ofg roup A was stronger than that in g roup B(0.007536±0.003851 vs 0.005126±0.006244,P＜0.05),and the latterwas stronger than thatof C g roup(0.005126±0.006244 vs 0.003444±0.002063,P＜0.05). Conclusion Tissue exp ression of CK19 in HT patients w ith multifocal PTC is higher than that in HT patients w ith unifocal PTC or in patients w ith HT alone,which suggests that strong ly positive exp ression ofCK19 in biopsy specimensmay ind icate HTw ithmultifocalPTC.

CK19 Hashimoto's thyroid itis Papillary thyroid carcinoma

2016-12-17）

（本文编辑：严玮雯）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.6.2016-2108

浙江省卫计委资助项目（2014KYA059）

310014杭州，浙江省人民医院干部科（夏清、严沛元）；浙江大学医学院附属第一医院甲状腺疾病诊治中心（谢小军、董帅）

董帅，E-mail：donshai@163.com