鱼腥藻PCC 7120中all3556蛋白的表达与纯化

2017-06-13王小琴李至敏雷国风李志敏

江西农业学报 2017年5期

王小琴，李至敏，雷国风，李志敏,3*

(1.江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045；2．江西农业大学理学院，江西南昌 330045；3.江西省农业微生物资源开发与利用工程实验室，江西南昌 330045)

王小琴1，李至敏2，雷国风1，李志敏1,3*

琥珀酸半醛脱氢酶在生物体中发挥重要的生理功能。通过BLAST序列分析，发现鱼腥藻PCC 7120中all3556基因编码琥珀酸半醛脱氢酶。实验通过常规PCR从鱼腥藻PCC 7120基因组中克隆了all3556基因，将该基因构建到pET-28a载体上并在大肠杆菌BL21(DE3)菌体中表达。经过SDS-PAGE电泳，结果表明：all3556蛋白可以在该表达体系中高效可溶性表达。利用镍亲和层析纯化方法得到了纯度大于95%的all3556蛋白，蛋白收率约为27 mg/g菌体。研究为进一步阐明all3556蛋白的催化功能及机制奠定了重要基础。

鱼腥藻PCC 7120；all3556蛋白；蛋白表达与纯化

蓝藻，又名蓝绿藻、蓝细菌，是目前发现的最早的光合释氧生物[1]。目前已知的蓝藻种类超过2000种，在地球上的分布十分广泛，遍及世界各地[2]。鱼腥藻PCC 7120是一种在化合态氮缺乏时能够形成异型细胞进行固氮生长的丝状蓝细菌[3]。自从2001年其全基因组序列测序完成后[4]，鱼腥藻PCC 7120已经成为蓝藻研究的模式生物之一。

由于在蓝藻中没有检测到α-酮戊二酸脱氢酶[5]，长久以来蓝藻都被认为不具备完整的三羧酸循环[6]。2011年的研究发现：在聚球藻PCC 7002中存在α-酮戊二酸脱羧酶和琥珀酸半醛脱氢酶[7]，这2个酶的作用是将α-酮戊二酸经过琥珀酸半醛转化成琥珀酸，从而使得蓝藻的三羧酸循环变得完整[8-9]。在聚球藻PCC 7002中编码琥珀酸半醛脱氢酶的基因是a2771基因。通过BLAST序列分析，本研究组发现在鱼腥藻PCC 7120中存在一个与a2771基因高度同源的all3556基因(碱基序列同源性为64.6%)，同时all3556和a2771蛋白的氨基酸序列同源性达到65.5%。因此，all3556蛋白也极有可能是琥珀酸半醛脱氢酶。

琥珀酸半醛脱氢酶(Succinic Semialdehyde Dehydrogenase,SSADH,EC 1.2.1.79)是一类NAD(P)+依赖型的氧化还原酶，催化琥珀酸半醛到琥珀酸的氧化反应，广泛存在于从细菌到哺乳动物等各种生物体内。在细菌中，SSADH对于维持细胞内的碳氮代谢平衡至关重要[10]。在真核生物中，SSADH在γ-氨基丁酸(GABA)代谢旁路途径发挥着重要作用[9,11-12]。在正常生理状态下，抑制性神经递质GABA在GABA转氨酶作用下将氨基转移到α-酮戊二酸上，生成谷氨酸和琥珀酸半醛，琥珀酸半醛经SSADH催化生成琥珀酸从而进入三羧酸循环。对于人类而言，SSADH缺乏症是一种罕见的常染色体隐性遗传病，会导致精神运动性阻滞、语言迟缓、行为障碍和惊厥等多种疾病[13-14]。在植物中SSADH缺失表现为不同的发育和表型变化等[15-16]。

由于SSADH广泛存在于各种生物体内，不同来源的SSADH在底物催化活性及NAD(P)+辅因子偏好性上有所差别。因此为了深入研究来源于鱼腥藻PCC 7120的SSADH的催化机制，本研究首先从鱼腥藻PCC 7120基因组中扩增all3556基因，将其连接到pET-28a载体后，通过大肠杆菌表达纯化得到all3556蛋白。初步试验表明：all3556蛋白是一个琥珀酸半醛脱氢酶，能够催化琥珀酸半醛到琥珀酸的转化(未发表数据)。本研究为进一步阐明all3556蛋白的催化功能及机制奠定了重要基础。

1 材料与方法

1.1 菌株和载体

感受态细胞DH5α、BL21(DE3)菌株购自北京全式金生物技术有限公司；表达载体pET-28a为本实验室保存；鱼腥藻PCC 7120基因组来自中科院青岛生物能源与过程研究所吕雪峰研究员实验室。

1.2 工具酶和主要试剂

限制性内切酶NdeⅠ、XhoⅠ购自NEW ENGLAND BioLabs公司；T4 DNA连接酶，5K DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司；Protein Marker购自Thermo scientific公司；2×Taq Mix、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；Ni-NTA购自QIAGEN公司；所用引物、质粒测序由上海祥音生物科技有限公司合成和完成；其他主要试剂均为分析纯，购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 目的基因的PCR扩增以鱼腥藻PCC 7120基因组(1 μL)为扩增模板，all3556-NdeⅠ(0.5 μL)和all3556-XhoⅠ(0.5 μL)为上下游引物(表1)，引物终浓度为0.2 pmol/μL。加入2×Taq Mix 25 μL后加灭菌水23 μL至总体积50 μL。扩增反应条件如下：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。反应结束后4 ℃保温。

表1 PCR引物序列

注：斜体为相应酶切位点。

1.3.2 pET28a-all3556重组质粒的构建与鉴定利用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切经琼脂糖凝胶电泳后回收的all3556基因片段。酶切反应体系如下：目的基因片段30 μL(约1 μg)，10×CutSmart缓冲液5 μL，NdeⅠ和XhoⅠ内切酶各1 μL，加灭菌水至50 μL。将反应体系置于37 ℃培养箱中2 h后用琼脂糖凝胶回收酶切片段。用同样的方法酶切pET-28a载体。之后于16 ℃金属浴恒温下用T4 DNA连接酶过夜连接酶切all3556基因片段与pET-28a线性片段(目的片段与载体片段的摩尔比为3∶1)。连接产物10 μL转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(50 μL)后，用含有50 μg/mL卡那霉素的LB固体平板培养基筛选阳性克隆。将经菌落PCR验证正确的阳性克隆摇菌后送检测序。

1.3.3 目的蛋白的诱导表达将测序正确的重组质粒pET28a-all3556转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB固体平板培养基上于37 ℃恒温过夜培养。将单克隆菌落加入到10 mL含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB液体培养基中于37 ℃，180 r/min下过夜培养。然后按1%接种量将过夜培养液加入至1000 mL LB液体培养基中(含有50 μg/mL卡那霉素)进行菌体扩大培养。待培养液OD600至0.6时加入IPTG(终浓度0.2 mmol/L)于20 ℃，180 r/min继续培养24 h。

1.3.4 all3556重组蛋白的分离纯化离心得到的菌体用10倍体积的binding buffer(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5缓冲液)重悬，于冰水浴中超声破碎27 min(超声工作2 s，间歇8 s，有效功率4%)。菌体裂解液于12000 r/min，4 ℃下离心30 min得到菌体上清液，经0.22 μm滤膜过滤后，将Ni-NTA树脂和过滤后的上清液混合于烧杯中磁力搅拌1 h，重新装柱后使用咪唑进行浓度梯度洗脱，分别收集每个浓度的流出液，用SDS-PAGE检测目的蛋白。合并含有目的蛋白的洗脱液后，于4 ℃下采用10K密理博超滤离心管脱盐浓缩，然后用Bradford方法对目的蛋白进行定量。

2 结果与分析

2.1 pET28a-all3556表达载体的构建与鉴定

用鱼腥藻PCC 7120基因组作为模板，经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳后获得约1.4 kb大小的DNA条带，该基因片段与all3556基因理论大小(1368 bp)相吻合(图1)。将双酶切后的目的基因片段和pET-28a载体经T4 DNA连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆摇菌后提取质粒。对提取的pET28a-all3556质粒进行NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，可见与目的片段大小相符的条带(图2)。将该质粒进行DNA测序，测序结果表明：该基因序列与NCBI数据库中的all3556基因序列完全一致。因此，构建得到了pET28a-all3556表达载体。

M：DNA marker；1、2：PCR产物

M:DNA marker；1：双酶切产物；2：阳性克隆质粒

2.2 all3556重组蛋白的诱导表达

含有pET28a-all3556表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌液在20 ℃，180 r/min 培养条件下经0.2 mmol/L IPTG诱导24 h后的表达情况如图3所示。all3556基因的碱基数为1368 bp，编码一个含有455个氨基酸残基的蛋白质，其分子量为48821.75 Da，与图3中泳道1～4中约50 kDa的条带相一致。泳道1～3为细胞破碎液，加样体积分别为2、4、8 μL。泳道4为细胞破碎液离心后上清液，加样体积为8 μL。由图3可知，all3556重组蛋白的表达量较高。另外由于泳道4的目的蛋白量接近于泳道3的目的蛋白量，因此all3556重组蛋白的溶解性非常好。

2.3 all3556重组蛋白的分离纯化

将含有目的蛋白的上清液与Ni-NTA温和搅拌1 h后装柱，用含有20～200 mmol/L咪唑的缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5)进行洗脱。亲和层析纯化如图4所示，当咪唑浓度增加到60 mmol/L时，少量all3556蛋白被洗脱。大部分all3556蛋白在咪唑浓度为200 mmol/L时被洗脱。合并图4中泳道6～8的洗脱液后脱盐浓缩，得到纯度大于95%的蛋白。用Bradford方法对浓缩后的蛋白进行浓度测定，最终得到蛋白浓度为35 mg/mL，蛋白收率约27 mg/g菌体。

M：蛋白质标准；1：2 μL细胞破碎液；2：4 μL细胞破碎液；3：8 μL细胞破碎液；4：8 μL离心后上清液

M：蛋白质标准；1：离心后上清液；2：流穿液；3～9：咪唑洗脱液(咪唑浓度分别为20、40、60、100、200、200、200 mmol/L)

图4 all3556重组蛋白的亲和层析纯化后电泳

3 结论与讨论

本文通过BLAST序列分析发现鱼腥藻PCC 7120中all3556蛋白与聚球藻PCC 7002中a2771蛋白的氨基酸序列同源性达到65.5%，而a2771蛋白已被证实为琥珀酸半醛脱氢酶[7,17-18]，是聚球藻PCC 7002三羧酸循环中的一个关键酶[7]，因此推测all3556蛋白为琥珀酸半醛脱氢酶。

本研究通过常规PCR技术从鱼腥藻PCC 7120基因组中成功克隆得到all3556基因，然后将其连接到pET-28a载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，阳性克隆经测序正确后得到表达质粒pET28a-all3556。表达质粒pET28a-all3556转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后得到表达菌株。研究表明：pET28a-all3556重组子在大肠杆菌BL21(DE3)中能高效表达并且表达的蛋白大部分为可溶性蛋白。破碎菌体后通过Ni亲和层析方法获得纯度较高的all3556蛋白，蛋白收率达到27 mg/g菌体。SDS-PAGE测得的all3556蛋白的分子量约为50 kDa，与all3556蛋白的理论分子量(48821.75 Da)比较接近。正在测试的试验数据表明：当用NADP+作辅因子时，all3556蛋白可以催化琥珀酸半醛到琥珀酸的转化。当用pH 8.5、50 mmol/L Tris-HCl缓冲液时，all3556蛋白的催化活性最高，其Km为0.01 mmol/L(琥珀酸半醛为反应底物)，kcat为0.4 s-1(未发表数据)。因此all3556蛋白是一个琥珀酸半醛脱氢酶。对all3556蛋白的详细酶动力学参数及结构功能关系的测定正在进行中。

聚球藻PCC 7002中a2770和a2771基因分别编码α-酮戊二酸脱羧酶和琥珀酸半醛脱氢酶[7]，这2个酶使得聚球藻PCC 7002的三羧酸循环变得完整。研究发现，除少数海洋蓝藻外，大部分蓝藻都存在与a2770、a2771同源性较高的基因[7]。在鱼腥藻PCC 7120中与a2770、a2771同源的基因分别是all3555、all3556，其基因同源性分别为77.3%、65.3%。现有的数据表明：all3556蛋白是琥珀酸半醛脱氢酶。因此为了证实鱼腥藻PCC 7120中三羧酸循环的关键酶，all3555基因是否编码α-酮戊二酸脱羧酶值得研究。

致谢：本课题研究得到了教育部留学回国人员科研启动基金项目的支持，谨致谢意!

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(责任编辑：曾小军)

Expression and Purification of Protein all3556 fromAnabaenasp. PCC 7120

WANG Xiao-qin1, LI Zhi-min2, LEI Guo-feng1, LI Zhi-min1,3*

(1. College of Bioscience and Bioengineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China; 2. College of Science, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China; 3. Jiangxi Provincial Engineering Laboratory for Development and Utilization of Agricultural Microbial Resources, Nanchang 330045, China)

Succinic semialdehyde dehydrogenase plays important physiological roles in the prokaryotes and eukaryotes. BLAST sequence analysis reveals that the geneall3556 inAnabaenasp. PCC 7120 encodes succinic semialdehyde dehydrogenase. The geneall3556 was cloned from the genome ofAnabaenasp. PCC 7120 by conventional PCR. Then the plasmid of pET-28a-all3556 was constructed by ligatingall3556 gene with pET-28a vector, and the expression ofall3556 in the competent cells ofEscherichiacolistrain BL21 (DE3) was observed. The results of SDS-PAGE showed that the protein all3556 could high-efficiently express in soluble form in this system. The protein all3556 was purified by Ni-NTA affinity chromatography, its purity was more than 95%, and its yield was about 27 mg/g wet cell. This study will lay an important base for further illustrating the catalytic function and mechanism of all3556 protein in the future.

Anabaenasp. PCC 7120; all3556 protein; Protein expression and purification

2016-12-12

国家自然科学基金项目(31400054和31560250)；江西省自然科学基金重大项目(20161ACB21012)。

王小琴(1993—)，女，江西上饶人，硕士研究生，研究方向：生物化学与分子生物学。*通讯作者：李志敏。

Q936

1001-8581(2017)05-0001-04