高效液相色谱法测定不同基质的食品中防腐剂含量

刘晓慧，刘 谦，吴新欣，郭力强，刘 萍

（河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心保定分中心，保定071051）

高效液相色谱法测定不同基质的食品中防腐剂含量

刘晓慧，刘 谦＊，吴新欣，郭力强，刘 萍

（河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心保定分中心，保定071051）

取固体样品（如糕点、肉肠等）2.000g，或液态样品（如饮料等）10.00mL，加少量水稀释后，加入220g·L－1乙酸锌和106g·L－1亚铁氰化钾溶液各2mL沉淀蛋白质并离心除去；取半固体样品（如果冻等）2.000g，加水稀释后用氨水（1＋1）溶液调节其酸度至pH 7～8，上述3种样品溶液均分别用水定容至25.0mL。所得溶液进行高效液相色谱分离，以TSK Eclipse XDB－C18色谱柱为固定相，和pH 5.0的甲醇－三乙胺缓冲溶液（1＋9）为流动相。苯甲酸和山梨酸的质量浓度均在0.1～10.0mg·L－1内与峰面积呈线性关系，检出限（3S／N）分别为1.8，1.2mg·kg－1。按标准加入法在3个浓度水平上进行回收试验，回收率在90%～97%之间，测定值的相对标准偏差（n＝6）均小于10%。

高效液相色谱法；防腐剂；食品；不同基质

近年来，食品安全事件频发，消费者对食品的安全性日益关注，特别是食品中的添加剂的使用情况越来越受到重视。过量使用添加剂会对人体健康造成一定的损害，因此卫生部制定了《食品添加剂使用卫生标准》［1］。苯甲酸和山梨酸是使用时间较长的食品防腐剂，对酵母、霉菌和部分细菌的抑制效果较好，在很多行业被广泛使用。如果苯甲酸添加过量，不仅能破坏维生素B1，影响人体对钙的吸收，刺激胃肠道，而且还会对人体肝脏造成危害，甚至致癌［2］。大多数文献只介绍了基质比较简单的固体样品或液体样品中防腐剂的测定方法［3］，在国家标准GB／T 5009.29－2003中，也仅有几类基质简单的食品中防腐剂的测定方法。在实际工作中，由于样品种类繁多，基质复杂，样品进样后常会出现柱压力升高、干扰物质与被测物质不能达到基线分离、目标峰保留时间飘忽不定等各类问题［4－9］，影响测定结果的准确性。本工作优化了前处理条件和高效液相色谱条件，采用高效液相色谱法对基质复杂的肉肠、奶制品等样品中防腐剂含量进行了测定。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

岛津LC－20AT型高效液相色谱仪，配LC－10Avp型紫外检测器；KQ－500型超声波清洗机；BAS224S型电子天平；3－30K型离心机。

苯甲酸标准储备溶液：1.00g·L－1。

山梨酸标准储备溶液：1.00g·L－1。

乙酸锌溶液：220g·L－1，称取乙酸锌220g，用少量水溶解，加入冰乙酸30mL，再用水定容至1L。

亚铁氰化钾溶液：106g·L－1，称取亚铁氰化钾106g，用水溶解并定容至1L。

三乙胺缓冲溶液：移取三乙胺2.0mL，加水溶解并稀释至1L，用冰乙酸调pH至5.0，经0.45μm微孔滤膜过滤。

甲醇为色谱纯，试验用水为超纯水，二者使用时均经0.45μm微孔滤膜过滤。

1.2 仪器工作条件

TSK Eclipse XDB－C18色谱柱（4.6mm× 150mm，5μm）；流动相为甲醇－三乙胺缓冲溶液（1＋9）混合液（pH 5.0）；检测波长230nm；流量1mL·min－1；柱温40℃；进样量10μL。

1.3 试验方法

1.3.1 糕点、肉肠类固体样品

称取已制备的粉碎均匀的试样2.000g，分别置于小烧杯中，用20mL水分数次清洗小烧杯，将样品完全移入25mL容量瓶中，超声振荡提取5min。取出后加亚铁氰化钾溶液2mL，摇匀，再加入乙酸锌溶液2mL，摇匀，用水定容，移入离心管中，以4 000r·min－1转速离心5min，吸取上清液，经0.45μm微孔滤膜过滤后，按仪器工作条件进行测定。

1.3.2 果冻等半固体样品

称取已粉碎均匀的试样2.000g，加水适量，转移至25mL容量瓶中，再加水至约20mL，置于60～70℃水浴中加热片刻，加塞，剧烈振摇，使样品在水中分散均匀。用氨水（1＋1）溶液调节酸度至pH 7～8，加塞，剧烈振摇，使样品在水中分散均匀，置于60～70℃水浴中加热30min，取出后趁热超声5min，冷却后用水定容至25mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，按仪器工作条件进行测定。

1.3.3 含乳饮料样品

移取乳饮料、植物蛋白饮料等含蛋白较多的样品10.00mL置于25mL容量瓶中，加亚铁氰化钾溶液2mL摇匀，再加入乙酸锌溶液2mL摇匀，以沉淀蛋白质，加水定容至25mL，以4 000r·min－1转速离心5min，吸取上清液，经0.45μm微孔滤膜过滤后，按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的选择

用乙酸锌－亚铁氰化钾溶液沉淀样品中的蛋白质，具有沉淀快速、滤液澄清的特点，但是易产生大量絮状沉淀，且对目标物也有不同程度的吸附作用，从而使样品回收率难以达到要求［2］。根据苯甲酸、山梨酸属于酸性防腐剂［5］的特点，对于果冻等食品样品，试验先加入少量氨水，调节溶液酸度至pH 7～8，使苯甲酸、山梨酸转变成易溶于水的苯甲酸盐及山梨酸盐，再进行后续的沉淀处理，即可达到满意的效果。试验选择的前处理条件见1.3节。

2.2 流动相组分的选择

按照国家标准GB／T 5009.29－2003的色谱条件，在流动相为乙酸铵溶液的条件下，3种样品基质中苯甲酸的色谱图见图1。

由图1可知：肉肠样品中苯甲酸在8.9min出峰，而此处有基质峰干扰，形成很宽的坡峰，目标峰与干扰峰无法达到完全分离，不能满足测定的要求；糕点基质中苯甲酸在13.7min出峰，而13.0，14.4min均有干扰峰，目标峰与干扰峰无法完全分离，易叠加；饮料基质中苯甲酸也受到干扰。

由于流动相中水相比例为95%，过多的水相会使色谱柱的C18填料变性而无法使用，且不能使目标峰和干扰峰完全分离，对日常测定工作带来困难。试验中考虑采用离子抑制法即向含水流动相中加入酸、碱或缓冲溶液等改性剂，以提高分离的选择性［6］。三乙胺作为一种常见的离子对试剂，经常被用在电离能力比较强的酸性化合物的测定中。使用离子对试剂后，在反相色谱柱上保留时间很短或根本不保留的样品会形成有效地保留。但经常使用三乙胺，会对色谱柱造成一定的影响。每次测定完毕后，及时用水相冲洗以避免对柱子填料的损伤。试验选用三乙胺溶液作为流动相，以苯甲酸为例，基质干扰峰明显能与目标峰分离，见图2。

图1 乙酸铵体系不同基质中苯甲酸的液相色谱图Fig.1 LC chromatograms of benzoic acid in different matrices in ammonium acetate system

图2 三乙胺体系不同基质中苯甲酸的色谱图Fig.2 Chromatograms of benzoic acid in different matrices in triethylamine

2.3 流动相酸度的选择

控制流动相的酸度，能有效抑制溶质的离子化，减少谱带拖尾现象，改善峰形。试验发现，流动相酸度的改变对目标峰的保留时间和选择性都有较大的影响。以肉肠样品为例，pH为6.0时，苯甲酸保留时间为8.1min，山梨酸保留时间为13.1min，此时苯甲酸前面有一个杂质峰干扰；当pH为5.0时，苯甲酸的保留时间延长至11.2min，与之前的干扰峰能完全分离，山梨酸保留时间延长至15.4min，见图3。

图3 不同酸度下三乙胺体系肉肠基质中苯甲酸和山梨酸的色谱图Fig.3 Chromatograms of benzoic acid and sortic acid in sausage matrix of different acidities in triethylamine systerm

通过多次试验发现，饮料类样品和果冻类半固体样品均存在此种现象。因此，试验选择流动相的pH为5.0。

2.4 标准曲线及检出限

将苯甲酸、山梨酸标准储备溶液用水适当稀释后，配制成0.1，0.5，1.0，2.0，10.0mg·L－1标准溶液系列，以其质量浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明：苯甲酸、山梨酸的质量浓度在0.1～10.0mg·L－1内呈线性，苯甲酸、山梨酸的线性回归方程分别为y＝4 516 x＋13.16，y＝2 316 x－1.86，相关系数均大于0.999。

按3倍信噪比计算苯甲酸和山梨酸的检出限（3S／N）分别为1.8，1.2mg·kg－1。

2.5 精密度和回收试验

选取空白肉肠、QQ星奶、果冻样品，分别添加3个浓度水平苯甲酸和山梨酸标准溶液进行加标回收试验，每个浓度水平平行测定6次，其加标回收率和测定值的相对标准偏差（RSD）见表1。

表1 精密度和回收试验结果（n＝6）Tab.1 Results of tests for precision and recovery

由表1可知：在肉肠、奶制品、果冻等复杂基质食品中，加标回收率都在90%以上，相对标准偏差小于10%，回收率和精密度均满足GB／T 27404－2008的要求。

2.6 样品分析

按试验方法分析糕点、肉肠、奶制品TFFU复杂基质样品1 300多批次，其中呈阳性样品的包括糕点180批和肉肠类64批，奶制品里未检出防腐剂，这是因为测定的奶制品主要是预包装的奶粉和酸奶类，未添加防腐剂。将阳性样品分别用本法和GB／T 5009.29－2003标准中气相色谱法进行测定，结果见表2。

表2 样品分析结果Tab.2 Analytical results of samples mg·kg－1

由表2可知：使用本法测定，苯甲酸从阳性样品改为阴性样品，山梨酸的测定结果均明显降低到GB 2760－2014中对糕点和肉肠规定的合格限量以下（糕点中山梨酸1 000mg·kg－1，肉肠中山梨酸1 500mg·kg－1）。

2015年，本实验室参加了中国检验检疫科学研究院测试评价中心的肉肠中苯甲酸的测定审核，采用GB／T 5009.29－2003标准方法中气相色谱法进行测定，结果为98.0mg·kg－1，与认定值（4.9mg·kg－1）偏差大，Z值为91.0，原因是肉肠基质中有干扰峰，改用本方法进行了分析，测定结果为5.3mg·kg－1，在合格范围内。

本工作采用高效液相色谱法对糕点、肉肠、果冻、奶制品、酱油等复杂基质食品中防腐剂进行测定，使用甲醇－三乙胺缓冲溶液（1＋9）混合液（pH 5.0）为流动相，有效解决了柱压过高、保留时间漂移、阳性检出样品定性困难、基质干扰现象严重等问题。方法快捷可靠，具有较好的准确度和重现性。

［1］ 谢兆辉，李学贵，许禔森.防腐剂苯甲酸（钠）测定方法的研究进展［J］.粮食与油脂，2015，28（3）：6－10.

［2］ 朱小梅，黄柳霞，廖权丰.反相高效液相色谱法同时测定黄豆酱中的苯甲酸、山梨酸、安赛蜜［J］.中国食品添加剂，2015（6）：194－202.

［3］ 陈亚成，贾彩凤，王疆元，等.牛乳中苯甲酸的HPLC测定及来源分析［J］.食品工业科技，2010，31（6）：94－95.

［4］ 张雪梅，池利民.高效液相色谱法测定熟肉制品中苯甲酸和山梨酸含量［J］.安徽农业科学，2009，31（13）：5823－5824.

［5］ 符传武，覃子龙.RP－HPLC法测定食用动物油脂中苯甲酸与山梨酸的含量［J］.中国酿造，2014，33（1）：143－146.

［6］ 杨凤艳，孙玉娟.高效液相色谱法测定腐乳中的苯甲酸、山梨酸［J］.中国卫生检验杂志，2010，20（8）：1873－1874.

［7］ 鞠福龙，李春娟，李东刚.气相色谱－质谱联用法同时检测调味品中7种防腐剂［J］.中国调味品，2009，34（10）：79－81.

［8］ 王萍，李洁，郑和辉.超高效液相色谱法测定化妆品中22种防腐剂［J］.中国卫生检验杂志，2009，19（6）：1291－1293.

［9］ 张瑾，丁晴，栾洁.HPLC法同时检测金银花露中6种防腐剂含量［J］.海峡药学，2013，25（9）：80－82.

HPLC Determination of Preservatives in Food of Various Matrixes

LIU Xiao－hui，LIU Qian＊，WU Xin－xin，GUO Li－qiang，LIU Ping
（Baoding Branch，Technical Center of Hebei Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Baoding071051，China）

The solid sample，e.g.cake，sausage and etc.，（2.000g）or liquid sample，e.g.，drinks etc.（10.00mL）was taken and diluted with some water.2mL of 220g·L－1zinc acetate solution and 2mL of 106g· L－1potassium ferrocyanide solution were added to precipitate protein and to remove it by centrifuge.In case of semisolid sample，e.g.，jelly，2.000g were taken and diluted with water.The acidity was adjusted to pH 7to 8with ammonia（1＋1）solution.The sample solution described above was made up to 25.0mL with water，and separated by HPLC using TSK Eclipse XDB－C18column as stationary phase and mixed solution of methanol and triethylamin（1＋9）（pH 5.0）as mobile phase.Linear relationships between values of peak area and mass concentration of benzoic acid and sorbic acid were found in the same range of 0.1－10.0mg·L－1，with detection limits（3S／N）of 1.8，1.2mg·kg－1，respectively.Test for recovery was made by standard addition method at 3concentration levels，giving results in the range of 90%－97%，with RSDs（n＝6）less than 10%.

HPLC；Preservative；Food；Various matrixes

O652.63

A

1001－4020（2017）04－0447－04

10.11973／lhjy－hx201704016

2016－03－17

刘晓慧（1980－），女，河北保定人，博士，研究方向为食品中微生物的检测。

＊通信联系人。E－mail：chemliuq＠163.com