五种核酸提取试剂盒对新城疫病毒RNA提取效率的比较

（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

五种核酸提取试剂盒对新城疫病毒RNA提取效率的比较

吕 艳，王静静，罗瑶瑶，李 林，赵云玲，郑东霞，左媛媛，于松梅，刘华雷，王志亮

（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

本研究采用罗氏、天隆、赛默飞世尔等公司生产的5种核酸提取试剂盒，对新城疫病毒RNA的提取效率进行比较，以优选出提取效率高、耗时短、成本低的核酸提取方法，为各级实验室开展新城疫病毒核酸检测提供技术参考。采用5种商品化核酸提取试剂盒，对不同浓度（稀释度100～10-8/EID50108.3）的新城疫病毒标准样品进行RNA提取，通过实时定量荧光RT-PCR进行检测，以Ct值评价5种试剂盒的RNA提取效率，并对试剂盒的RNA提取时间和价格等进行综合比较分析。结果显示：High Pure Viral RNA Kit（罗氏）、动物疫病病毒RNA核酸提取试剂盒（天隆）和LabServ Viral Total NA Kit（赛默飞世尔）的RNA提取效率较高。其中，LabServ Viral Total NA Kit对低浓度样本的RNA提取效率最高，价格最便宜；Tian Long的RNA提取所需时间也较短，但操作最为简便。综合提取效率、时间及成本等因素，分析认为LabServ Viral Total NA Kit（赛默飞世尔）性价比最高，适用于大批量临床样品的集中检测。

新城疫病毒；RNA提取；荧光RT-PCR

新城疫（Newcastle Disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）强毒引起的一种禽类急性、高度接触性传染病[1]，在全球许多国家和地区均有发生或流行。该病是世界动物卫生组织（OIE）法定报告动物疫病，是我国一类动物疫病，也是《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020年）》中确定的优先防控的重大动物疫病之一。按照《国家动物疫病监测与流行病学调查计划》的有关要求，各级动物疫病防控机构需要开展ND的病原学监测和免疫效果评估。对于病原学监测，目前常用的方法包括病毒分离与鉴定，以及普通RT-PCR和荧光RT-PCR等核酸检测。对于病毒核酸检测，除了检测试剂盒的特异性、敏感性和重复性等因素对检测结果影响较大外，病毒RNA的提取效率对其影响也非常大。早期，病毒RNA的提取主要采用硫氰酸胍法、CTAB法、Trizol法、反复冻融法和溶壁酶法等[2-3]。这些传统提取方法操作繁琐，提取效率低，易污染，且很难实现自动化。随着高分子材料的快速发展，RNA提取技术已由传统的液相系统分离技术转变为固相载体吸附技术，如膜吸附技术、磁珠吸附技术等。近几年，市场上也出现了多种基于固相载体的RNA提取试剂盒。本研究对常用的5种病毒RNA提取试剂盒的提取效率、时间及成本等进行综合比较，为实验人员合理选择RNA提取方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 毒株

3株NDV强毒尿囊液（EID50108.3）由本实验室保存，分别编号为毒株1、2、3 ；用PBS（0.01 M，pH 7.4）对3株病毒分别作10倍梯度稀释，制备10-1～10-8稀释度样品，于-20 ℃保存备用。

1.2 试剂

High Pure Viral RNA Kit（批号11696800）、MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit（批号12066700）、MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Small Volume Kit（批号18922500），由罗氏诊断有限公司提供；动物疫病病毒RNA核酸提取试剂盒（批号E0115040411），购自西安天隆科技有限公司；LabServ Viral Total NA Kit（批号00LSKFR805496C19O005），购自赛默飞世尔科技公司；新城疫病毒强毒荧光RT-PCR检测试剂盒，由国家新城疫参考实验室提供。

1.3 主要仪器设备

NP968 Nucl eic Acid Extraction System（西安天隆科技有限公司）；Thermo KingFisher Flex 磁珠法核酸提取仪（赛默飞世尔科技公司）；MagNA Pure LC 2.0全自动核酸纯化系统（罗氏诊断有限公司）；MagNA Pure 96 全自动核酸纯化系统（罗氏诊断有限公司）；LightCycler® 480Ⅱ荧光定量PCR仪（罗氏诊断有限公司）。

1.4 RNA提取

对High Pure Viral RNA Kit，采用离心柱吸附技术，按照试剂盒说明书，手动提取病毒RNA；对其余4种试剂盒，均采用磁珠法，按照试剂盒说明书，运用相应核酸提取仪，自动提取病毒RNA。5种试剂盒所用样品均为200 μL，核酸洗脱液体积为100 μL，每份样品（稀释度10-1～10-8）平行做2次RNA提取。所用5种RNA提取方法见表1。

1.5 荧光RT-PCR

采用国家新城疫参考实验室提供的新城疫强毒荧光RT-PCR核酸检测试剂盒，对不同方法制备的病毒RNA进行检测。荧光RT-PCR反应条件：50 ℃ 30 min；95 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，60 ℃1 min，进行45个循环，60 ℃收集荧光信号。每个样品做2个重复，通过Ct值比较不同试剂盒的RNA提取效率。

表1 5种RNA提取方法的比较

2 结果

2.1 RNA提取效率比较

利用5种试剂盒，分别提取3份NDV原液，通过荧光RT-PCR进行检测。结果显示，不同提取方法和不同样品在提取效率上有一定差异，High Pure Viral RNA Kit试剂盒的离心柱法和磁珠法试剂盒的效果相当，Roche LC 2.0试剂盒的Ct值较高（图1）。

图1使用5种提取方法对3株NDV提取效果比较（误差线为平均值的标准差）

2.2 重复性分析

利用5种试剂盒，2次平行提取病毒原液RNA，并以其为模板进行荧光RT-PCR扩增；重复2次，根据荧光RT-PCR的Ct值计算变异系数（CV=标准差/平均值），评价方法的重复性。High Pure Viral RNA Kit、Tian Long、Thermo KingFlex、Roche LC 2.0、Roche Pure 96试剂盒的变异系数分别为0.022 829、0.016 261、0.016 555、0.031 033、0.046 504，说明Tian Long试剂盒重复性最好，Thermo KingFlex试剂盒次之。

随机选取1株NDV进行10倍梯度稀释，以10-1～10-8稀释度样本为模板，进行荧光RT-PCR扩增，根据Ct值评价各试剂盒对不同浓度样品的RNA提取效率。结果显示，在样品被梯度稀释后，High Pure Viral RNA Kit、Tian Long和Thermo KingFlex试剂盒的提取效率较好，其中Thermo KingFlex试剂盒对低浓度尿囊液的提取率最高（图2）。

图2 5种RNA提取试剂盒对不同浓度样品的RNA提取效率比较

2.3 提取时间及价格比较

High Pure Viral RNA Kit为手动提取，耗时最长。按照1人标配24孔离心机来算，提取96份样品需4 h左右，其余4种试剂盒均有配套核酸提取仪，可通过仪器自动化或半自动化提取。其中Tian Long试剂盒上机前手动加样最为简便，Roche Pure 96试剂盒提取RNA耗时最短。5种试剂盒中，Roche Pure 96试剂盒价格较贵，检测1份样品约36元；Thermo KingFlex试剂盒对较便宜，约25元/份样品（表2）。由于各实验室试剂采购途径不同，参考价格会有所差异，表中所列价格仅供参考。

3 讨论

目前，NDV的病原学诊断主要依靠分子生物学技术，即常规RT-PCR、荧光RT-PCR和焦磷酸测序技术等。在所有的分子诊断方法中，病毒RNA提取是分子生物学检测的关键环节之一，RNA的提取效率和质量直接影响最终检测结果的准确性。因此，选择一种高效的RNA提取方法，对NDV的核酸检测至关重要。早期的RNA提取方法主要依靠液相系统分离技术，包括硫氰酸胍法、CTAB法、Trizol法、反复冻融法和溶壁酶法等[2-3]。这些传统方法操作繁琐、费时，提取率低，易污染，且操作人员可能需要直接接触有毒的化学试剂。随着高分子材料学的快速发展，提取核酸的关键技术逐渐转变为固相载体吸附技术，包括旋转离心柱提取法、玻璃粉吸附法、二氧化硅基质法、阴离子交换法和纳米磁珠提取法等[4]。其中离心柱法已被普遍应用。该方法提取率较高且质量稳定，但至今未实现高通量自动化操作。纳米磁珠法是一种新兴的核酸提取方法，目前已被众多实验室采用。该方法提取效率高，且可通过仪器自动化批量提取，操作简单。目前，市售的RNA提取试剂盒主要采用膜吸附技术（离心柱提取法）和磁珠吸附技术（纳米磁珠法）。这些试剂盒在提取效率、时间、成本等方面存在较大差异[5]。本研究利用荧光RT-PCR技术检测NDV RNA，通过Ct值评价病毒RNA提取效率，并对常见的5种RNA提取试剂盒进行综合比较，以期能找到一种提取效率高、耗时短、成本低的病毒RNA提取方法。

研究发现，在提取效率方面，High Pure Viral RNA Kit（罗氏）、动物疫病病毒RNA核酸提取试剂盒（天隆）和LabServ Viral Total NA Kit（赛默飞世尔）明显优于另外2种试剂盒。对于低浓度的病毒样本（稀释度为10-8/EID50为108.3），5种试剂盒均具有很好的RNA提取效率均效高，其中LabServ Viral Total NA Kit（赛默飞世尔）的RNA提取效率最高。在重复性方面，5种试剂盒无明显差异。综合耗时、成本等其他因素比较发现，High Pure Viral RNA Kit（罗氏，离心柱吸附法）为手工操作，耗时费力，不适合大批量样本集中检测，但其收集的RNA为单管单独分装，无需再次转移，可防止RNA交叉污染，因此在样品数量较少时较为实用。其余4种试剂盒均依靠磁珠吸附技术，具有配套的核酸提取仪器，可实现全自动化或半自动化操作。动物疫病病毒RNA核酸提取试剂盒（天隆）是唯一的国产试剂盒，为预装试剂盒，只需手动加入待检样品和少量试剂，操作简便，且有多种规格可供选择。但该仪器1次最多提取32个样品，成本相对较高。LabServ Viral Total NA Kit（赛默飞世尔）虽可同时提取96个样品，但所有试剂和样品均需手动加入，操作相对繁琐。目前该试剂盒已有预装试剂盒出售，且成本较低，是大批量样品检测的首选试剂盒。MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit（罗氏）和配套仪器每次最多可提取32个样品RNA，试剂和样品均需手动加入，操作复杂，且RNA提取效率最低。罗氏公司出售的MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Small Volume Kit为预装试剂盒，操作简单，可同时提取96个样品，RNA提取效率明显高于MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit，但与另外3种方法相比，仍有一定差距，且耗材成本较高。因此，综合考虑RNA提取试剂盒的提取效率、时间和成本等因素，认为LabServ Viral Total NA Kit（赛默飞世尔）的性价比最高，是大批量样品检测的最佳选择。

[1] 王志亮，刘华雷. 新城疫[M]. 北京：中国农业出版社，2012：1-3.

[2] CHIRGWIN J M，PRZYBYLA A E，MACDONALD R J，et al. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease[J]. Biochemistry，1979，18（24）：5294-5299.

[3] 王淼，马学军. 核酸提取方法的研究进展[J]. 中华实验和临床病毒学，2014，28（6）：503-505.

[4] 刘洪波，刘晓雷，罗小铭. 核酸提取方法进展[J]. 现代生物医学进展，2011，16：3187-3190.

[5] 赵怡，陈苏红，刘志红，等. 6种核酸提取试剂盒对甲型H1N1流感病毒核酸提取效果的比较[J]. 军事医学科学院院刊，2010，34（2）：111-114.

（责任编辑：朱迪国）

Comparison on RNA Extraction Eff i ciency of Five Nucleic Acid Extraction Kits for Newcastle disease Virus

Lü Yan，Wang Jingjing，Luo Yaoyao，Li Lin，Zhao Yunling，Zheng Dongxia，Zuo Yuanyuan，Yu Songmei，Liu Hualei，Wang Zhiliang
（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

In order to select a RNA extraction kit with high extraction eff i ciency in a short time and at a low price，the Newcastle disease viruses（NDVs）were used and the RNA extraction eff i ciency of fi ve RNA extraction kits produced by Roche，Tian Long and Thermo were compared. In the study，the RNA of NDV samples with different virus titers（Dilution100～10-8/EID50108.3）was extracted using five RNA extraction kits，the RNA extraction efficiency was evaluated by the Ct value of real-time RT-PCR，and the RNA extraction time and the price of kits were compared. The results showed the RNA extraction eff i ciency of High Pure Viral RNA Kit（Roche），Tian Long RNA extraction kit（Tian Long），and LabServ Viral Total NA Kit（Thermo）was higher than the other two kits. And for the samples with low virus titers，the RNA extraction eff i ciency of LabServ Viral Total NA Kit（Thermo）was the highest . Among all the fi ve kits，Tian Long RNA extraction kit was the most convenient one with the shortest time，while the LabServ Viral Total NA Kit was the cheapest. Considering of the RNA extraction eff i ciency，the time and the price，LabServ Viral Total NA Kit（Thermo）is better than the other kits and is the best choice for the detection of mass samples.

Newcastle disease virus（NDV）；RNA extraction；real-time RT-PCR

S852.65

：B

：1005-944X（2017）06-0098-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.06.028

公益性行业科研专项（210303033）；国家重点研发计划项目（2016YFD0500800）并列第一作者：吕 艳、王静静

刘华雷、王志亮