MALAT1通过VHL/β-catenin通路影响口腔鳞状细胞癌生长侵袭的实验研究*

2017-06-09王佳鑫段远胜岳恺司海山董梦丽周梦倩王旭东

中国肿瘤临床 2017年9期

王佳鑫段远胜岳恺司海山董梦丽周梦倩王旭东

·基础研究·

王佳鑫段远胜岳恺司海山董梦丽周梦倩王旭东

目的：探讨肺腺癌转移相关转录因子1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）对口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）生长侵袭的影响及其作用机制。方法：使用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）敲低MALAT1在人OSCC细胞系SCC25、UM1中的表达；CCK-8法、流式细胞术检测敲低MALAT1表达后OSCC增殖能力、细胞周期及细胞凋亡的变化；细胞迁移实验及Transwell实验检测细胞运动及侵袭能力的变化；蛋白质印迹法检测细胞周期及凋亡相关蛋白、上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及侵袭相关蛋白、VHL及β-catenin等蛋白表达变化。结果：敲低OSCC中MALAT1表达后，细胞增殖能力显著下降，细胞周期出现G1/S期阻滞，周期相关蛋白cyclin D1表达减少，P21表达增多；细胞凋亡增多，凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、Bax表达增多；且EMT相关蛋白N-cadherin、vimentin表达减少，E-cadherin表达增多，侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9蛋白表达减少，细胞迁移、侵袭能力下降；同时发现敲低MALAT1表达后VHL蛋白表达增多，β-catenin蛋白表达减少。结论：MALAT1是OSCC生长侵袭的重要调节因素，可能通过VHL/β-catenin通路发挥调控作用。

口腔鳞状细胞癌肺腺癌转移相关转录因子1 VHL β-catenin

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是头颈部鳞状细胞癌中最常见的类型，局部浸润侵袭能力强，易发生颈部淋巴结转移，手术难以彻底切除已经浸润周围组织和发生远处转移的肿瘤［1-2］。近30年来，尽管化疗、放疗和靶向治疗等均有长足的发展，但头颈部鳞癌的总体预后却不佳。

肺腺癌转移相关转录因子1（metastasis associat⁃ed lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）是长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）家族的重要成员，通过消减杂交法在非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）的研究中被发现，其长度约为8 700 bp，定位于人类染色体11q13［2］。最新研究显示，MALAT1在人类多种疾病，尤其是恶性肿瘤发生发展中发挥重要作用。MALAT1在食管癌［3］、胶质瘤［4］、肾癌［5］等多种人类恶性肿瘤中异常表达，是肿瘤预后不良的因素。本课题组前期研究发现，在OSCC中MALAT1高表达与患者预后差密切相关［6］，提示MALAT1可能参与OSCC恶性进展。本研究旨在探讨MALAT1对OSCC增殖、凋亡及迁移侵袭能力的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人OSCC细胞株SCC25、UM1（购自美国ATCC生物资源中心），P160、Tscca（由中国医学科学院基础医学研究所惠赠），Tb3.1（由上海交通大学第九人民医院惠赠），蛋白抽提试剂盒（购自上海碧云天生物技术有限公司），Trizol抽提试剂（购自美国Invitrogen公司），RNA逆转录试剂盒（购自日本TAKARA公司），CCK8试剂盒（购自日本同仁公司），细胞周期试剂盒（购自北京天根生化科技有限公司），引物序列（购自上海生物工程公司），Matrigel（购自美国BD公司），细胞凋亡试剂盒（购自美国BD公司），胎牛血清（购自美国Hyclone公司），DMEM/F12培养基、MEM/EBSS培养基、RPMI 1640培养基（购自美国Hyclone公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养人OSCC细胞株SCC25、UM1常规培养于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，Tscca培养于含10%胎牛血清的MEM/EBSS培养基，P160、Tb3.1培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，置37℃、5%CO2培养箱孵育，0.25%胰酶-EDTA消化传代。

1.2.2 反转录RT-PCR方法检测MALAT1在细胞中的表达用Trizol提取总RNA；参照逆转录试剂盒说明书加样并进行反应，产物cDNA置于-20℃保存。引物序列：内参β-actin上游：5'-CACAGCAAGAGAGGCATCC-3'；下游：5'-CTGGGGTGTTGAAGGTCTC-3'。MALAT1上游：5'-GACGGAGGTTGAGATGAAGC-3'；下游：5'-AT TCGGGGCTCTGTAGTCCT-3'。MALAT1的PCR条件：95℃30s，95℃5s，60℃34 s，共进行40次循环。

1.2.3 MALAT1 siRNA转染将处于对数生长期的SCC25、UM1细胞常规消化后接种于6孔细胞培养板中，12～24 h后（融合度60%～80%），加入无血清DMEM/F12，分组进行转染。实验共分为2组：1）阴性对照组：10 μL脂质体+10 μL无意义对照序列RNA（正义序列：5'-UUC UUCGAACGUGUCACGUTT-3'；反义序列：5'-ACGUGA CACGUUCGGAGAATT-3'）；2）MALAT1 siRNA组：10 μL脂质体+10 μL MALAT1 siRNA（正义序列：5'-GAGGUG UAAAGGGAUUUAUTT-3'；反义序列：5'-AUAAAUCCC UUUACACCUCTTT-3'）。转染6 h后换为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基继续培养。

1.2.4 CCK-8检测细胞增殖能力 96孔板每孔铺5× 103个经转染过的细胞，分别在0、24、48、72 h加入10 μL CCK-8溶液，混匀，细胞培养箱内继续培养2 h后，酶标仪450 nm波长测吸光度值。

1.2.5 流式细胞术PI单染检测细胞周期收集转染48 h后的细胞用预冷生理盐水洗涤细胞1次，将细胞重悬于体积分数75%乙醇溶液中，在4℃冰箱过夜。然后1 500 r/min离心5 min去除乙醇溶液并用生理盐水洗涤细胞1次，细胞重悬至200 μL生理盐水，加10 mg/mL PI染液1 μL和10 mg/mL RNase A溶液1 μL，避光4℃孵育30 min，上流式细胞仪进行检测。

1.2.6 流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染分析细胞凋亡将转染48 h后的细胞用胰酶消化细胞，取（5～6）×105细胞加入500 μL 1×Binding Buffer、5 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI，轻轻混匀室温下避光15 min后上机检测。同时以不加AnnexinV-FITC及PI的细胞悬液作为阴性对照。

1.2.7 Transwell侵袭实验将转染48 h后的细胞进行消化，重悬于无血清DMEM/F12培养液中，接种到Matrigel覆盖的Transwell上层小室内，小室底部为含血清培养基500 μL。24 h后取出小室，多聚甲醛固定3 min，结晶紫染色5 min，倒置显微镜下观察。随机取3个视野拍照计数，计算每个视野内的穿膜细胞数。

1.2.8 细胞迁移实验将转染48 h后的细胞进行消化，重悬于无血清DMEM/F12培养液中，接种到Tran⁃swell上层小室内，小室底部为含血清培养基500 μL。8 h后取出小室，多聚甲醛固定3 min，结晶紫染色5 min，倒置显微镜下观察。随机取3个视野拍照计数，计算每个视野内的穿膜细胞数。

1.2.9 蛋白质印迹法检测相关蛋白的表达转染48 h后提取总蛋白，测定蛋白浓度，SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，冰浴下300 mA转膜120 min。37℃封闭1 h，剪膜后分别加入一抗4℃孵育过夜，复温1 h，相应加入辣根酶标记的小鼠二抗或兔二抗（1∶2 000）室温孵育1 h。加发光液后用成像系统检测蛋白条带的表达。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 实时定量PCR筛选高表达MALAT1 OSCC细胞系并验证siRNA敲低效果

实时定量PCR结果显示，P160、Tb3.1、UM1、SCC25和Tscca 5种OSCC细胞系中，UM1和SCC25高表达MALAT1；筛选UM1和SCC25进行体外细胞实验。转染MALAT1 siRNA 48 h后，UM1、SCC25细胞系MALAT1的表达较阴性对照组明显降低（图1）。

图1 实时定量PCR筛选高表达MALAT1的OSCC细胞系并验证siR⁃NA的敲低效果Figure 1 Effect of knockdown with MALAT1 siRNA verified by real-time polymerase chain reaction assay

2.2 敲低MALAT1表达后，细胞增殖能力、细胞周期及相关蛋白表达变化

CCK-8实验结果显示，经转染MALAT1 siRNA的SCC25、UM1细胞，其增殖能力受到显著抑制（图2，P<0.05）。运用流式细胞术检测处理前后细胞周期的改变，发现SCC25细胞系G1期细胞比例由（41.02± 1.66）%增加至（61.48±1.66）%；S期细胞比例由（49.92±1.17）%降低至（36.02±1.54）%；UM1细胞系G1期细胞比例由（44.58±1.00）%增加至（59.63±0.51）%；S期细胞比例由（48.18±1.82）%降低至（32.49± 1.51）%。G0/G1期细胞增多，S期减少，细胞出现G1/S期阻滞，且差异具有统计学意义（P<0.05）。同时Western blot结果表明SCC25、UM1细胞系细胞周期素cyclin D1蛋白表达较阴性对照组降低，细胞周期抑制蛋白P21表达较阴性对照组升高（图3）。

图2 CCK-8法检测细胞增殖能力变化Figure 2 Cell counting kit-8 assay indicated the cell proliferation change

2.3 敲低MALAT1表达后细胞凋亡及相关蛋白表达变化

流式细胞仪检测阴性对照组与MALAT1 siRNA组细胞凋亡的变化，SCC25、UM1细胞系凋亡率分别由（4.43± 0.51）%、（4.07±0.90）%增加到（10.40±0.60）%、（11.67± 0.91%），差异具有统计学意义（P<0.05）。同时Western blot法发现cleaved caspase-3及促凋亡蛋白Bax的表达水平较阴性对照组明显上调（图4）。

2.4 敲低MALAT1表达后细胞迁移侵袭能力及EMT相关蛋白表达的变化

细胞迁移实验及Transwell实验结果显示，SCC25、UM1细胞系转染MALAT1 siRNA 48 h后各随机计数3个视野，与阴性对照组比较，MALAT1 siRNA组穿膜细胞数均明显减少，差异均具有统计学意义（均P<0.05）。E-cadherin蛋白表达上调，N-cadherin及vimentin蛋白表达下调，侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9表达下调（图5）。

2.5 敲低MALAT1表达后Western blot法检测VHL、β-catenin蛋白表达变化

转染MALAT1 siRNA 48 h后，SCC25、UM1细胞系中VHL蛋白表达上调，β-catenin蛋白表达下调（图6），提示MALAT1在OSCC中，可能通过VHL调控βcatenin通路。

图3 MALAT1 siRNA处理后细胞周期及相应蛋白表达变化Figure 3 Changes in the cell cycle and the expression of related proteins after cell infection by MALAT1 siRNA

图4 MALAT1 siRNA处理后细胞凋亡及相关蛋白表达变化Figure 4 Changes in cell apoptosis and the expression of related proteins after cell infection by MALAT1 siRNA

图5 MALAT1 siRNA处理细胞后细胞迁移侵袭能力及EMT相关蛋白表达的变化Figure 5 Changes in cell migration and invasion and the expression of EMT-associated protein after cell infection by MALAT1 siRNA

图6 MALAT1 siRNA处理细胞后VHL、β-catenin通路蛋白的表达变化Figure 6 Western blot analysis of the protein expression levels of VHL and β-catenin

3 讨论

lncRNA是长度介于200 bp～10 kb之间的一类转录本，广泛参与机体的生理和病理过程，从转录到mRNA剪切、RNA修饰直至翻译，几乎每一步基因活动周期都受到lncRNA的影响［7］。MALAT1是最早发现的lncRNA之一，在乳腺癌、NSCLC、肝癌、肾细胞癌、宫颈癌、结肠癌等多种人类恶性肿瘤中存在过表达或突变现象，与肿瘤的增殖、侵袭转移等生物学行为密切相关［8］。本课题组前期对96例OSCC标本分析发现，MALAT1在OSCC组织中表达明显高于癌旁组织和正常口腔组织，并且高表达MALAT1与患者预后差密切相关［6］，提示MALAT1与OSCC的恶性进展相关，但其发挥作用的具体机制尚不清楚。

有研究认为，肿瘤恶性进展是一个涉及多因素、多信号通路参与的复杂生物学过程［9］，这些因素导致肿瘤细胞周期改变、凋亡减少、极性和表面分子蛋白改变、发生细胞重塑、运动迁移能力增强，进而启动肿瘤恶性进展［2］。近年来的研究显示，MALAT1可在表观遗传、转录以及转录后等多层面发挥对蛋白质表达的调控作用，进而影响肿瘤的发生发展［10-11］。骨肉瘤细胞中高表达MALAT1通过调节PI3K/AKT信号通路增强细胞的增殖能力［12］；在肝细胞肝癌中MALAT1通过上调SRSF1并且激活mTOR促进肿瘤发展［13］。本研究结果显示，敲低OSCC细胞中MALAT1表达后，G1期细胞增多，S期细胞减少，细胞周期出现阻滞，细胞增殖能力显著降低；同时可见细胞凋亡增多。表明高表达MALAT1参与调控OSCC细胞生长增殖。

上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是肿瘤发生侵袭转移的前期事件，本课题组前期实验已证实OSCC中存在EMT现象，且OSCC的EMT促进肿瘤侵袭转移，是预后不良的重要因素［14］。胆囊癌中，MALAT1通过激活ERK/MAPK通路促进胆囊癌细胞转移［15］；NSCLC中MALAT1通过调控肿瘤细胞EMT过程影响肿瘤脑转移［16］。本研究结果显示，敲低MALAT1在OSCC细胞中的表达后，E-cadherin表达上调，N-cadherin、vimentin表达下调，OSCC的EMT过程发生逆转，提示OSCC中MALAT1参与调控OSCC的EMT过程。进一步实验发现，随OSCC的MALAT1表达水平的降低，侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9表达下调，同时可见OSCC细胞迁移运动能力和侵袭能力减弱，说明MALAT1表达影响OSCC的迁移侵袭过程。由此可见，在OSCC中，高表达MALAT1可通过诱导EMT过程促进OSCC细胞的迁移侵袭。

恶性肿瘤中MALAT1通过多种途径发挥调控作用。MALAT1作为SC35剪接结构域的一个组成成分，通过SC35区域作用影响前体mRNA的剪接，进而调控基因表达［10］；其次，MALAT1亦可通过与多种蛋白结合发挥基因表达调控作用，MALAT1与多梳抑制复合物1（PRC1）的CBX4亚基结合导致CBX脱甲基化，调控生长控制基因的沉默或激活，从而影响细胞的生长活动；亦或与多梳抑制复合物2（PRC2）EZH2亚基结合，募集EZH2对下游靶基因发挥表观遗传学调控功能［17］。另外，MALAT1参与调控信号转导通路，影响肿瘤进展。Wnt/β-catenin通路在肿瘤的恶性进展中功能作用已被证实，与肿瘤细胞增殖、凋亡、分化、迁移及侵袭等多种生物学行为密切相关，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用［18］。肝癌、结直肠癌、肾癌等多种恶性肿瘤均存在MALAT1介导Wnt/β-catenin信号通路诱导肿瘤EMT促进肿瘤侵袭转移的调节机制。本课题组前期研究证实，在OSCC标本中β-catenin高表达，与OSCC的EMT和淋巴结转移相关。本研究结果显示，敲低MALAT1表达后可见β-catenin表达水平下降，β-catenin通路下游靶基因如cyclin D1，E-cadherin的表达水平也发生相应变化，推测MALAT1可能通过β-catenin通路发挥下游调控作用；敲低MALAT1表达，β-catenin表达降低的同时可见VHL表达升高，提示MALAT1同时调控VHL、β-catenin表达水平。正常情况下，β-catenin在无上游刺激时可被Axin/APC降解复合物磷酸化，随后经泛素-蛋白酶体途径被降解；VHL作为E3泛素连接酶的组成部分，是调节β-catenin转录活性与亚细胞定位的重要分子，VHL蛋白能通过激活泛素降解通路降解β-catenin［19］。本课题组前期实验证明［20］，VHL在OSCC组织中低表达，恢复OSCC的VHL表达能够显著抑制胞核及胞质中β-catenin表达水平。因此MALAT1可能通过调控VHL/β-catenin通路影响OSCC细胞生长侵袭过程。

综上所述，MALAT1在OSCC中高表达，调控OS⁃CC增殖、凋亡、EMT及侵袭等过程，这一作用可能是通过VHL/β-catenin通路实现的。更深入的作用机制还有待于进一步研究和探索。

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（2017-03-03收稿）

（2017-04-05修回）

（编辑：孙喜佳校对：张亻抿）

Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1 modulates the growth and invasion of oral squamous cell carcinoma through the VHL/β-catenin pathway in vitro

Jiaxin WANG,Yuansheng DUAN,Kai YUE,Haishan SI,Mengli DONG,Mengqian ZHOU,Xudong WANG

Xudong WANG;E-mail:wxd.1133@163.com Department of Otorhinolaryngology and Maxillofacial Oncology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital;National Clinical Research Center for Cancer;Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin;Tianjin's Clinical Research Center for Cancer; Tianjin 300060,China This work was supported by National Natural Science foundation of China(No.81672684)and Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital Scientific Fund(No.1601)

Objective:To investigate the effect and mechanism of metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1(MALAT1)in modulating the growth and invasion of oral squamous cell carcinoma(OSCC).Methods:MALAT1 siRNA was transfected into SCC25 and UM1 human OSCC cell lines.Cell counting kit-8 assay and flow cytometry were used to test the proliferation,cell cycle,and apoptosis of the cells after infection by the MALAT1 siRNA.Cell invasive and migration ability were evaluated by Transwell assay and cell migration assay,respectively.The expression levels of the proteins VHL and β-catenin,which regulate the cell cycle,apoptosis,epithelialmesenchymal transition,invasion,and migration,were examined by Western blot assay.Results:After down regulation of the MALAT1 expression in the cells,the proliferation was inhibited,and G1/S arrest was triggered.The expression of cyclin D1 was down regulated and that of P21 was up regulated.Cell apoptosis increased,and the expression levels of Bax and cleaved caspase-3 were up regulated. Migration and invasion were attenuated.The expression levels of N-cadherin,vimentin,and MMP-2/9 were down regulated,and the expression of E-cadherin was up regulated in the cells after the knockdown of MALAT1.These findings show significant differences between the transfected cells and negative-control cells.We found that VHL expression was up regulated and that of β-catenin was down regulated.Conclusion:MALAT1 is an important factor for the growth and invasion of OSCC.MALAT1 possibly modulates these processes through the VHL/β-catenin signal pathway.

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