髓样分化因子88基因rs7744多态性与冠状动脉粥样硬化性心脏病易感性及严重程度的关系

孙丹丹，吴玉鹏，刘文，闫虹，王红鹄，杨军

（中国医科大学附属第一医院1.心血管超声科；2.神经外科，沈阳110001）

髓样分化因子88基因rs7744多态性与冠状动脉粥样硬化性心脏病易感性及严重程度的关系

孙丹丹1，吴玉鹏2，刘文1，闫虹1，王红鹄1，杨军1

（中国医科大学附属第一医院1.心血管超声科；2.神经外科，沈阳110001）

目的探讨中国北方汉族人群髓样分化因子88（MyD88）基因3’非编码区（3’-UTR）rs7744多态性与冠状动脉粥样硬化性心脏病（CAD）发病风险及严重程度的关系。方法收集2013年9月至2015年9月中国医科大学附属第一医院血液标本810例。CAD组540例，对照组270例，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术检测rs7744多态性，并收集临床资料。结果MyD88基因rs7744符合Hardy-Weiberg平衡（P＞0.1）。对MyD88基因rs7744多态性与CAD发病风险的关系进行总体和分层分析。MyD88基因rs7744多态位点，年龄＜50岁，AG突变杂合型携带者CAD的发病风险是AA野生纯合型携带者的0.38倍（95%CI:0.17～0.93；P=0.029）。对MyD88基因rs7744多态性与CAD严重程度的关系进行冠状动脉病变支数及改良Gensini评分分析。在改良Gensini评分分析中，MyD88基因rs7744多态位点，GG突变纯合型携带者的改良Gensini评分显著低于AA野生纯合型携带者（5.23±3.85 vs 7.49±4.96；P=0.011）。结论MyD88基因3’-UTR区rs7744多态性与CAD发病风险及严重程度存在关联关系。携带rs7744突变基因型的年龄＜50岁人群，CAD的发病率比较低。rs7744突变基因型携带者的改良Gensini评分显著低于野生型携带者。

冠状动脉粥样硬化性心脏病；发病风险或易感性；改良Gensini评分；髓样分化因子88；基因多态性

冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary artery disease，CAD）是冠状动脉发生粥样硬化，形成斑块，造成血管狭窄或阻塞，从而导致心肌缺血、缺氧［1］。慢性炎症反应是其发生的主要机制之一［2］。髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）是炎症反应通路中的重要配体，参与Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）和白细胞介素1受体（interleukin-1 receptor，IL-1R）介导的免疫反应，上调炎性细胞因子（IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、干扰素和黏附因子等）的表达［3-5］。研究［6］表明，MyD88基因rs7744多态性与动脉粥样硬化的发生相关。因此推测MyD88基因rs7744多态性可能也与CAD的发生发展相关。本研究以中国北方汉族人群为对象，探讨MyD88基因3’非编码区（3’-untranslated region，3’-UTR）rs7744多态性与CAD易感性及严重程度的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

采用以医院为基础的病例-对照研究，收集2013年9月至2015年9月中国医科大学附属第一医院810例血液标本。所有入选者均行冠状动脉造影术，并签署知情同意书。CAD组540例（男239例，女301例），年龄27～84（59.14±9.51）岁，CAD诊断均符合1997年国际心脏病学会、协会及WHO临床命名及诊断标准。对照组270例（男115例，女155例），年龄26～87（58.58±10.47）岁，冠状动脉造影结果显示冠状动脉狭窄＜50%。所有研究对象均排除严重的肝肾疾病、血液病、自身免疫性病、急性脑血管疾病及急性外周血管血栓病。以电话咨询或病历记录方法收集入选者性别、年龄及其他相关临床资料（吸烟史、饮酒史、高血压史、糖尿病史、血压、血脂、血糖和冠状动脉造影等）。

1.2 冠状动脉病变程度评价

1.2.1 冠状动脉病变支数：一支病变，一支主要冠状动脉（左前降支、回旋支、右冠状动脉）阻塞≥50%；两支病变，两支主要冠状动脉阻塞≥50%；三支病变，三支主要冠状动脉阻塞≥50%。左主干阻塞≥50%归为两支病变。

1.2.2 改良Gensini评分系统：冠状动脉分为8个主要节段，对每个节段中最重的狭窄病变进行定量评分。0分，无任何狭窄；1分，1%～＜50%狭窄；2分，50%～＜75%狭窄；3分，75%～＜100%狭窄；4分，100%狭窄。各段评分之和为总积分。

1.3 基因组DNA提取及基因分型

5 mL外周静脉血置于促凝试管内，分离血清和凝血块。酚-氯仿法提取血凝块中人基因组DNA。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技术对MyD88基因rs7744进行基因分型。上游引物为5’-AGGGAGCCTAACCA TGTCACTGA-3’，下游引物为5’-AGGGTCTGTCGTG GGGCACA-3’。PCR反应体系包括：10×Buffer 2.5 μL（含MgC l 225 nmol/L），4种dNTP混合物2 μL，10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL，2.5 U的Taq DNA酶0.25 μL，模板DNA 0.5 μL，最后加去离子水至25 μL。PCR反应条件：94℃预变性3 min，然后按94℃30 s，61℃30 s，72℃30 s，进行35个循环，72℃延伸10 min。取10 μL PCR产物与限制性核酸内切酶37℃过夜。全部酶切产物于3.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统分析电泳结果。

1.4 统计学分析

采用应用SPSS 13.0统计学软件进行数据处理。计量资料以x±s表示，组间计量资料比较采用ANOVA检验；计数资料以频率表示，组间计数资料比较采用χ2检验；MyD88基因rs7744多态性与CAD发病风险及与CAD病变支数的关联关系采用多因素logistic回归模型。不同基因型之间，改良Gensini评分的比较采用ANOVA检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料比较

CAD组及对照组，年龄、性别、饮酒与否均无统计学差异（P＞0.05）。与对照组相比，CAD组吸烟、高血压、糖尿病、高血脂均增加（P＜0.05），见表1。

MyD88基因rs7744 3种基因型之间，年龄、性别、吸烟、饮酒、高血压、高血脂、糖尿病均无统计学差异（P＞0.05），见表2。

表1 CAD组与对照组一般临床资料比较Tab.1 Clinical data of subjects in the CAD and control groups

表2 MyD88 rs7744 3种基因型一般临床资料比较Tab.2 Clinical data of subjects carrying the three genotypes of MyD88 rs7744

2.2 MyD88基因rs7744多态性分型

MyD88基因rs7744野生型AA为1个片段，291 bp；突变杂合型AG为3个片段，分别为291 bp、172 bp和119 bp；完全突变型GG为2个片段，172 bp和119 bp（图1）。3种基因型在对照组中的分布为AA型99例（36.6%），AG型126例（46.8%），GG型45例（16.6%）；在CAD组中的分布为：AA型212例（39.3%），AG型256例（47.4%），GG型72例（13.3%）；rs7744符合Hardy-Weiberg平衡（P＞0.1）。

2.3 MyD88基因rs7744多态性与CAD发病率的关系

对MyD88基因rs7744多态性与CAD发病风险的关系进行总体和分层分析。总体分析结果显示，rs7744多态性与CAD的发病风险无统计学意义（P＞0.05），见表3。在年龄分层中，年龄＜50岁人群，MyD88基因rs7744多态性AG突变杂合型携带者CAD的发病风险是AA野生纯合型携带者的0.38倍（95%CI：0.17～0.93；P=0.029），见表4。

图1 MyD88 rs7744多态性的PCR-RFLP琼脂糖凝胶电泳图谱Fig.1 PCR-RFLP assay for analyzing MyD88 rs7744 polymorphism

表3 MyD88基因rs7744多态性与CAD发病风险的关系Tab.3 Relationship of the MyD88 rs7744 polymorphism with CAD risk

2.4 MyD88基因rs7744多态性与CAD严重程度的关系

对MyD88基因rs7744多态性与CAD严重程度的关系进行冠状动脉病变支数及改良Gensini评分。总体分析结果显示，rs7744多态性与冠状动脉病变支数无统计学意义（P＞0.05，表5）。在改良Gensini评分分析中，MyD88基因rs7744多态位点，GG突变纯合型携带者的改良Gensini评分显著低于AA野生纯合型携带者（5.23±3.85 vs 7.49±4.96；P= 0.011），见表6。

表4 MyD88基因rs7744多态性与CAD发病风险关系的分层分析Tab.4 Stratification analysis of the association between MyD88 rs7744 and CAD risk

3 讨论

研究［7］发现中国CAD发病率逐年增加，已经成为我国人口死亡的主要原因。近来研究［8］表明，多种分子机制参与CAD的发生发展，如炎症细胞因子损害、心肌细胞代谢障碍、细胞内Ca2+超载、氧自由基损伤、兴奋性氨基酸毒性损伤等，其中，炎症反应是重要的机制之一。MyD88分子是TLR介导的先天免疫反应以及IL-1受体和IL-8受体介导的信号通路中一个重要的接头蛋白，参与活化NF-κB信号通路及RAS/ERK信号通路，诱导炎性细胞因子（IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、干扰素和黏附因子等）的表达［5，9］，在炎症反应中发挥重要作用。本研究发现，MyD88基因rs7744多态性与CAD的易感性相关，并参与影响CAD的严重程度。

表5 MyD88基因rs7744多态性与冠状动脉病变支数的关联关系Tab.5 Relationship of the MyD88 rs7744 polymorphism with the number of coronary stenosis

表6 MyD88基因rs7744多态性与改良Gensini评分的关联关系Tab.6 Relationship of the MyD88 rs7744 polymorphism with the modified Gensini score

有研究［10］表明MyD88基因敲除或基因突变与动脉粥样硬化及其并发症密切相关。FAN等［11］研究显示敲除MyD88基因或者抑制MyD88基因表达后可起到减少大鼠缺血大脑炎症反应；DOWNES等［12］研究报道敲除MyD88基因后大鼠脑梗死面积扩大。古联等［13］研究表明MyD88基因rs7744多态性与缺血性中风患者LDL水平显著相关。而CHEN等［6］对131例动脉粥样硬化闭塞症患者及270例健康对照者的研究中发现，MyD88基因rs7744多态性与动脉粥样硬化闭塞症的发生相关。其分子机制可能是：（1）基因3’-UTR区转录后的mRNA可以与小RNA结合，从而使靶标的mRNA降解或翻译抑制，该区域发生变异可能会通过影响靶基因的表达而改变其生物学功能［14］。rs7744位点位于MyD88基因的3’-UTR区，在该位点100 bp范围内，具有与miR-150-3p和miR-1236结合的位点［15］。因此推测在rs7744位点由A等位基因突变为G等位基因时，miR-150-3p和miR-1236与MyD88mRNA结合能力发生改变，使MyD88表达受到影响。（2）MyD88基因rs7744多态位点与ACAA1基因rs156265多态位（启动子区）点高度连锁不平衡（r2=0.9）。ACAA1基因rs156256多态位点可以影响内毒素的生成［16］。rs7744多态位点与rs156256多态位点相互作用，可能影响基因的表达，进而影响CAD的易感性及严重程度。

本研究表明，在年龄＜50岁人群中，MyD88基因rs7744多态位点AG突变杂合型的携带者发生CAD概率显著低于AA野生纯合型的携带者。FU等［17］研究表明，血清中MyD88的表达随着年龄的增长逐渐降低。这可以部分解释本研究的结果，MyD88基因rs7744多态性可能对年龄较小人群CAD的易感性影响更为显著。本研究还表明，MyD88基因rs7744多态位点，GG突变纯合型携带者的改良Gensini评分显著低于AA野生纯合型携带者。改良Gensini评分不但能评价CAD患者血管阻塞的数目，还可以评价血管阻塞的程度及范围。以往的研究［18］表明，MyD88与动脉血管重构、内膜增生及脂质沉积有关。因此，MyD88基因rs7744多态位点突变型可能会通过影响冠状动脉内膜增生及重构来影响CAD的严重程度，即改良Gensini评分。

综上所述，本研究首次报道了MyD88基因3’-UTR区rs7744多态性与CAD发病风险存在关联关系。其中，携带rs7744突变基因型的年龄＜50岁人群CAD的发病率比较低。rs7744多态性与CAD的严重程度相关。rs7744突变基因型携带者的改良Gensini评分显著低于野生型携带者。本研究为临床易发生CAD的人群提供早期预警，并对CAD进展的治疗提供理论基础；但样本量相对较小，仍需要大样本多中心的相关研究来进一步验证结果。

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（编辑 武玉欣）

Relationship of MyD88 rs7744 Polymorphism with the Risk and Severity of Coronary Artery Disease

SUN Dandan1，WU Yupeng2，LIU Wen1，YAN Hong1，WANG Honghu1，YANG Jun1

（1.Department of Cardiovascular Ultrasound，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Neurosurgery，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

Objective To investigate the association between rs7744 polymorphism in the 3’-untranslated region（3’-UTR）of myeloid differentiation factor 88（MyD88）gene and the risk and severity of coronary artery disease（CAD）in a North Chinese Han population.MethodsThe CAD and control groups consisted of 540 patients and 270 subjects，respectively.The genotypes of rs7744 were detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP），and clinical data were collected.ResultsThe distributions ofMyD88rs7744 were in HWE（P＞0.1）.In the＜50-year-old age group，a lower risk of CAD was observed for subjects carrying the variant AG genotype in comparison to subjects carrying the wild AA genotype（OR=0.38，95%CI:0.17-0.93，P=0.029）.TheMyD88rs7744 polymorphism was also related to the modified Gensini score（P=0.011），which was lower in subjects carrying the variant GG genotype than the wild AA genotype（5.23±3.85 vs 7.49± 4.96）.ConclusionOur results revealed thatMyD88rs7744 polymorphism in the 3’-UTR is correlated with the risk and severity of CAD.

coronary artery disease；disease risk or susceptibility；modified Gensini score；myeloid differentiation factor 88；polymorphism

R541.4

A

0258-4646（2017）06-0519-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.009

辽宁省自然科学基金（2015020506）

孙丹丹（1983-），女，主治医师，博士.

杨军，E-mail：yangjun@cmu1h.com

2017-01-06

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