镰刀菌毒素对全价日粮发酵淀粉和挥发性脂肪酸的影响

周敏，李会荣，李祥明，杨在宾，杨维仁，张桂国，姜淑贞*

（1.山东农业大学动物科技学院，山东泰安271018；2.山东省饲料质量检验所，山东济南250022）

饲料卫生

镰刀菌毒素对全价日粮发酵淀粉和挥发性脂肪酸的影响

周敏1，李会荣2，李祥明2，杨在宾1，杨维仁1，张桂国1，姜淑贞1*

（1.山东农业大学动物科技学院，山东泰安271018；2.山东省饲料质量检验所，山东济南250022）

本试验以镰刀菌毒素为研究对象，研究镰刀菌毒素对全价日粮发酵淀粉和挥发性脂肪酸的影响。试验分为3个处理，对照组为基础日粮，试验1组（25M yco.）和2组（50M yco.）分别用25%和50%含有镰刀菌毒素的玉米和玉米蛋白粉代替基础日粮中的玉米和玉米蛋白粉。采用复合菌种对全价日粮进行固态发酵，发酵开始前所有处理日粮水分调节至50%。试验结果表明：（1）本试验条件下，日粮的淀粉含量随发酵时间呈线性下降（P＜0.05），日粮的丁酸、乙酸含量随发酵时间呈先线性上升（P＜0.05），而后下降；（2）日粮（0 d）的淀粉和乙酸含量随着镰刀菌毒素水平的提高显著降低（P＜0.05）；（3）发酵末期（18 d）的淀粉、乙酸和丁酸含量各处理组差异不显著（P＞0.05）。由此说明，镰刀菌毒素及其水平可显著影响全价日粮发酵的淀粉、丁酸和乙酸水平。

镰刀菌毒素；发酵产物；淀粉；乙酸；丁酸

镰刀菌毒素是一些霉菌在谷类作物或者饲料加工过程中滋生繁殖、分泌产生的一种有毒代谢产物（彭杰等，2009）。在自然界中分布极为广泛，每年全世界受霉菌污染的原料损失量占总损失量的比例最高（孙飞等2014）。在我国，越来越多的作物原料、饲料产品遭受霉菌的污染甚至是重度污染（王金勇，2012）。镰刀菌可侵染多种禾谷类作物，能引起作物出现根腐、萎蔫、穗腐等多种腐烂病，不仅能够导致农作物减产，而且降低谷类作物品质和食用价值。此外，镰刀菌产生的多种毒素能使人畜中毒，霉变的作物对人类和动物的健康造成严重威胁（肖湘等，2012；伍庆斌，2011）。随着饲料工业的发展，微生物发酵饲料已在全世界广泛应用（王秀，2010）。因物理、化学方法具有降解成效不稳定、营养物质流失和影响动物饲料适口性等缺点，生物降解以其降解程度高、无污染等优点备受关注和研究（乔霞等，2014；计成，2012；陆文清等2008）。Gourama等（1995）研究发现，通过嗜酸乳酸杆菌、保加利亚乳酸杆菌和植物乳酸杆菌等多种乳酸杆菌共同发酵可以抑制寄生曲霉孢子的产生；叶丙奎等（2009）研究证明，饲喂固态发酵日粮可以提高育肥猪的采食量和日增重；余淼等（2013）研究证明，肉牛食用微生物发酵的饲料，有效改善了消化吸收功能且提高了免疫力。国内外有关发酵研究主要集中在发酵可改善常规饲料和原料的营养价值、降解原料中的抗营养因子，而镰刀菌毒素对发酵参数的研究还鲜有报道。本试验旨在研究复合菌种发酵对镰刀菌毒素日粮淀粉和挥发性脂肪酸的影响，为生产中霉变饲料的处理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料发酵菌种：乳酸菌（Lactobacillus），5×109cfu/g；酵母菌（Yeast），4.6×109cfu/g，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），1.9×1010cfu/g；北京科为博生物科技有限公司提供。

镰刀菌毒素原料选择：本课题组于2014年6月至12月相继从山东省13个饲料厂和12个养殖场抽检饲料原料样品共计135个，检测其霉菌毒素含量，调查霉菌毒素污染状况。从中选择毒素水平低于检测限的原料配制对照日粮，选择含有镰刀菌毒素的玉米和玉米蛋白粉配制试验日粮。

1.2 试验设计试验分3个处理，每个处理3个重复，每个重复18桶。对照组为基础日粮，试验1组（25Myco.）和试验2组（50Myco.）分别用25%和50%的含有镰刀菌毒素的玉米和玉米蛋白粉代替基础日粮中的玉米和玉米蛋白粉，使50%镰刀菌素日粮的玉米赤霉烯酮含量刚刚超过我国仔猪小于500mg/kg的限量标准（GB 13078.2-2006）。

1.3 试验日粮断奶仔猪基础日粮是参考美国NRC（1998）营养需要来配制的，用已知镰刀菌毒素的玉米和玉米蛋白粉代替基础日粮中的玉米和玉米蛋白粉配制成含有100%镰刀菌毒素日粮，随后用100%镰刀菌素日粮和对照日粮按照1∶3比例配制成25Myco.日粮，用100%的镰刀菌素日粮和对照日粮按照1∶1比例配制成50Myco.日粮。日粮组成及营养水平见表1。

表1 日粮组成及营养水平（风干基础）

1.4 试验方法

1.4.1 样品的制备与采集发酵试验开始前将一定比例发酵菌种（乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌分别为6.33×106cfu/g、1.05×106cfu/g和8.94×106cfu/g）配制成水溶液，均匀喷洒在所有试验日粮中，然后喷洒蒸馏水，调节水分含量至50%，搅拌均匀，装入塑料桶（50±0.36 kg），密封发酵，发酵温度为16~18°C。

日粮密封前采样作为第0天的样品，然后分别于日粮发酵的第3、6、9、12、15、18天采集样品，每个重复随机选择3桶，采样完毕弃去。采样方法：距离桶边约20 cm做一个圆，在圆上划一个“十”字，“十”字与圆的4个交点和圆心作为取样点；分别在距离发酵桶上表面约20 cm处、桶底约20 cm处和桶的中央采样，每个采样点采样约500 g，然后将每个桶的上、中、下15个点的样品混合，立即进行感官评价。按照四分法缩样，最后将样品平均分成2份（每份约500 g），一份置于60℃烘箱中制成风干样，粉碎用于测定DM、CP、Ca、P常规营养成分和毒素含量（张丽英，2003），另一份置于-20℃保存，用于淀粉和挥发性脂肪酸（VFA）含量测定。

1.4.2 样品测定

1.4.2.1 毒素测定采用免疫亲和柱层析净化，以液相色谱法荧光检测器测定玉米赤霉烯酮的含量，外标法定量。采用免疫亲和层析净化高效液相色谱-串联质谱法，以液相色谱结合紫外检测器测定伏马毒素B1和呕吐毒素的含量，外标法定量。玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马毒素、T-2毒素和呕吐毒素的最低检测限为分别为0.1 mg/kg、1.0μg/kg、0.5μg/kg、0.25 mg/kg、0.02μg/kg和0.1mg/kg。

1.4.2.2 淀粉的测定采用蒽酮比色法测定日粮淀粉含量。（1）试剂的配制。试剂一：80%乙醇溶液；试剂二：52%高氯酸溶液；蒽酮-硫酸试剂：准确称取0.4 g蒽酮溶于100mL 88%硫酸溶液中，现用现配。（2）淀粉标准液及标准曲线绘制。淀粉标准液：准确称取200mg淀粉于烧杯中，加入5mL蒸馏水和65mL试剂二，搅拌溶解，转入100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，此淀粉溶液浓度为2 mg/mL；移取上述溶液10 mL于250 mL容量瓶中，蒸馏水定容，作为淀粉标准溶液，此淀粉标准溶液的浓度为80μg/mL。

标准曲线：分别移取换算成淀粉含量分别为0、10、20、40、60、80μg标准液于试管中，加蒸馏水使各试管中溶液均为2mL，冰水浴中冷却2min，加入6 mL蒽酮-硫酸试剂，摇匀，再在冰水浴中冷却2 min。随后将试管放入沸水浴中5 min，冷却至室温。用0μg淀粉作为空白参比，用分光光度计，于640 nm波长下比色，测定吸光度，以吸光度为横坐标，淀粉浓度作为纵坐标，绘制标准曲线。

步骤：①准确称取2.5 g发酵饲料样品于50mL离心管中；②滴加2滴试剂一湿润样品，再加入5 mL蒸馏水摇匀，加入25 mL热的试剂一，漩涡振荡器摇匀，静置5 min；③在2 500 r/min离心5 min，弃除上清液；④加入30mL试剂一和5mL水于残渣中，摇匀后静置5 min，2500 r/min离心5 min，弃除上清液；⑤加入30 mL试剂二和5 mL水于残渣中，搅拌混合10 min，以2500 r/min离心10min，将上清液转入100mL容量瓶中作为提取液；⑥再加入35 mL试剂二和5 mL水于残渣中，搅拌混合10 min，以2500 r/min离心10 min，上清液与⑤中提取液合并，以蒸馏水定容；⑦定量滤纸过滤提取液于干净锥形瓶中，移取10 mL滤液于250mL容量瓶中，蒸馏水定容；⑧取⑦中淀粉提取液2 mL于试管中，冷水浴2 min，然后加入6mL蒽酮-硫酸试剂，旋窝振荡器上充分混匀。再冷水浴2 min，沸水浴5 min，此时各试管中溶液呈蓝绿色，冷去至室温，用分光光度计，于640 nm波长下进行比色，测定吸光度。

计算公式：淀粉/%＝G/M×100；

式中：G为由饲料样品提取液测定的吸光度，由标准曲线回归公式计算出来的淀粉毫克数；M为饲料样品的质量。

1.4.2.3 挥发性脂肪酸（VFA）的测定样品中VFA含量是采用气相色谱法（美国安捷伦Agilent Technotogies 7890A）测定的。

样品处理：称取3 g发酵饲料样品，加入10mL 20%偏磷酸溶液，置于振荡器上振荡1.5 h，然后通过有机滤膜（水系，0.22μm）3层，存入1.5mL离心管中，放在4℃冰箱中待测。

色谱参数：采用程序升温法，初始温度为110℃，以10℃/min升温至150℃，保持5min。检测器参数：FID温度为230℃，H2流量40mL/min，空气流量450mL/min，尾吹流量45mL/min。进样口参数：温度200℃，载气高纯氮气，分流比为20∶1，进样量为1μL。

1.5 数据处理试验数据采用SAS 9.2软件进行统计，用单因素方差进行统计分析，用Duncan’s进行多重比较。其中不同发酵时期理化指标变化采用Excel进行分析。

2 结果与分析

2.1 镰刀菌毒素对全价饲料发酵淀粉含量的影响由图1可知，发酵初始（0 d）对照组淀粉含量显著高于25%镰刀菌素组和50%镰刀菌素组（P＜0.05），25%毒素组和50%毒素组差异不显著（P＞0.05）。随着发酵的进行，各处理组不同时间点淀粉水平差异不显著（P＞0.05）。各处理组日粮淀粉随发酵时间的延长均呈显著下降趋势（P＜0.05）。结果表明，对照组、25%毒素组和50%毒素组均在发酵15 d时达到稳定状态。随日粮中镰刀菌毒素增加，发酵淀粉随时间的斜率逐渐增大（表2），但3个处理的斜率两两差异不显著（P＞0.05）。

图1 饲粮淀粉随时间变化的折线图

表2 淀粉的普通截距多元线性回归（d-0，3，6，9，12，15，18）

2.2 镰刀菌毒素对全价饲料发酵乙酸含量的影响由图2可知，毒素水平显著影响发酵0、3、6、9 d和12 d的乙酸水平（P＜0.05）。对照组（发酵第0天和3天）乙酸含量显著高于25%毒素组（P＜0.05），25%毒素组又显著高于50%毒素组（P＜0.05）；对照组（发酵第9天和12天）乙酸含量显著高于25%毒素组和50%毒素组（P＜0.05），而25%毒素组和50%毒素组差异不显著（P＞0.05）。日粮乙酸含量随发酵时间呈线性升高（P＜0.05），而后呈现下降趋势。分析表明，25%毒素组和50%毒素组在发酵12 d时就达到稳定状态，而对照组在发酵15 d时达到稳定状态。随日粮中镰刀菌毒素增加，发酵乙酸随时间的斜率先减小后增大（表3），但3个处理的斜率两两差异不显著（P＞0.05）。

图2 饲粮乙酸随时间变化的折线图

表3 乙酸的普通截距多元线性回归（d-0，3，6，9，12，15，18）

2.3 镰刀菌毒素对全价饲料发酵丁酸含量的影响由图3可知，毒素水平显著影响发酵6、9、12 d的丁酸水平（P＜0.05）。发酵第6天时，25%毒素组和50%毒素组丁酸含量显著高于对照组（P＜0.05），而25%和50%毒素组差异不显著（P＞0.05）；第9天时，25%毒素组丁酸含量显著高于对照组和50%毒素组（P＜0.05），而对照组和50%毒素组差异不显著（P＞0.05）；第12天时，25%毒素组显著高于50%毒素组（P＜0.05）。日粮中丁酸随发酵时间呈线性上升（P＜0.05），而后下降至稳定。分析表明，对照组和25%毒素组在发酵15 d时就达到稳定状态，而50%毒素组在发酵12 d时达到稳定状态。随日粮中镰刀菌毒素增加，发酵丁酸随时间的斜率先减小后增大（表4），但三个处理的斜率两两差异不显著（P＞0.05）。

图3 日粮丁酸随时间变化的折线图

表4 丁酸的普通截距多元线性回归（d-0，3，6，9，12，15，18）

3 讨论

3.1 镰刀菌毒素对全价饲料发酵淀粉的影响淀粉是影响畜禽生长性能的重要指标之一（王海东等，2008）。乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌均能够利用碳水化合物发酵糖类（李永凯等，2009）。黄治国等（2012）跟踪白酒生产整个发酵期并对采集酒醅样品进行测定发现，淀粉消耗量比较大，并且呈现迅速下降趋势，在本试验发酵过程中，淀粉也表现出随时间迅速降低的趋势。霉菌在生长繁殖过程中分泌的酶也会分解和消耗饲料中的营养物质（史莹华等，2006）。因此，25%毒素组和50%毒素组的淀粉含量低于对照组。

3.2 镰刀菌毒素对全价饲料发酵VFA的影响Cohen等（1984）和Ren等（1997）研究表明，可溶性碳水化合物的发酵以丁酸型发酵为主，终产物主要为丁酸、乙酸及少量的丙酸，产丁酸菌同时会受到发酵终产物的抑制（艾斌凌，2014）。因此，丁酸出现先升后降的趋势。发酵初始阶段以产乙酸菌为主，乙酸的产生速率大于消耗速率，出现乙酸增加，后期由于产甲烷菌活性的加大，乙酸的消耗速率大于产生速率，因此乙酸呈下降趋势（Zhao等，2008）。陈斌等（2015）在研究玉米秸秆干式厌氧发酵时发现，乙酸产生也呈先增后降的趋势。本试验中乙酸、丁酸含量也有相同的规律。本研究中毒素处理组乙酸水平低可能与处理组淀粉含量低于对照组有关，但是毒素对VFA的影响机理尚需进一步证明。

4 结论

4.1 本试验条件下，日粮中淀粉含量随着发酵时间呈线性下降，丁酸和乙酸含量随着发酵时间呈先升高后下降趋势，但是不同处理的线性斜率差异不显著。

4.2 日粮（0 d）的淀粉和乙酸含量随着镰刀菌毒素水平的提高显著降低。

4.3 发酵末期（18 d）的淀粉、乙酸和丁酸含量各处理组间差异不显著。

[1]艾斌凌.基于混合菌群的水稻秸秆丁酸发酵过程优化与机制研究：[博士学位论文][D].哈尔滨：哈尔滨工业大学，2014.

[2]陈斌，杨天学，耿向永，魏自民，席北斗，赵越，李雪.玉米秸秆干式厌氧发酵乙酸产生规律及其对发酵的影响[J].环境科学研究，2015，28（4）：647～652.

[3]黄治国，侯海波，罗惠波，等.浓香型白酒酒醅发酵过程中淀粉和还原糖的变化规律研究[J].中国酿造，2012，31（7）：107～110.

[4]计成.饲料中霉菌毒素生物降解的研究进展[J].中国农业科学，2012，45（1）：153～158.

[5]陆文清，胡起源.微生物发酵饲料的生产与应用[J].饲料与畜牧：新饲料，2008，7：5～9.

[6]李永凯，毛胜勇，朱伟云.益生菌发酵饲料研究及应用现状[J].畜牧与兽医，2009，3：90～93.

[7]彭杰，吴晓鹏，黄惠琴，等.镰刀菌毒素研究进展[J].中国农学通报，2009，2：25～27.

[8]乔霞，杜军，周学章.霉菌毒素降解剂的研究进展[J].中国畜牧兽医，2014，41（1）：108～112.

[9]孙飞，方热军.饲料中霉菌毒素的研究进展[J].湖南饲料，2014，2：34～37.

[10]史莹华，王成章，孙宇，等.饲料中霉菌毒素的危害及其控制[J].河南农业大学学报，2006，40（6）：683～686.

[11]王海东，董致远，吕小文，等.颗粒饲料淀粉糊化度的快速检测方法[J].农业工程学报，2008，24（12）：249～253.

[12]王金勇.2011年全球霉菌毒素调查报告[J].国际资讯，2012，48（14）：49～52. [13]伍庆斌.霉菌毒素是养鸡业的隐性杀手[J].养禽与禽病防治，2011，8：11～12.

[14]王秀.发酵饲料在养猪生产中的应用与研究进展[J].江西饲料，2010.1. [15]肖湘，李文平.霉菌毒素的毒性作用及对畜禽养殖业的危害研究进展[J].湖南饲料，2012，1：25～27.

[16]叶丙奎，李青旺，谢伟华，等.混合固态发酵对生长育肥猪生产性能的影响[J].西北农业学报，2009，18（5）：22～26.

[17]余淼，严锦绣，彭忠利，等.微生物发酵饲料对肉牛免疫机能的影响[J].中国畜牧兽医，2013，40（4）：114～117.

[18]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局国家标准化管理委员会.饲料中储曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允许量（GB 13078.2-2006）.中华人民共和国国家标准，2006.

[19]张丽英.饲料分析及饲料质量检测技术[M].北京：中国标准出版物，2006.

[20]Cohen A，Van Gemert，JM，Zoetemeyer R J，et al.Main characteristics and stoich iometric aspects of acidogenesis of soluble carbohydrate containing waste water[J].Process Biochem.，1984，19：228.

[21]Gourama H，Bullerman L B.Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus：Aflatoxigenic fungiof concern in foodsand feeds：A review[J].Journal of Food Protection誖，1995，58（12）：1395～1404

[22]Ren N，Chen X L，Zhao D.Control of fermentation types in continuous-flow acidogenic reactor[J].Biotechnology&Bioengineering，1997，54（5）：428.

[23]Zhao Q B，Yu H Q.Fermentative H2production in an upflow anaerobic sludge blanket reactor at various pH values[J].Bioresource technology，2008，99（5）：1353～1358.

This experimentwas conducted to study the effects of fusarium toxin on fermentation parameters of starchand and volatile fatty acid of compound feed.The experiment was divided into 3 treatments，the control group was the basal diet，the testgroup 1（25Myco.）and 2（50Myco.）were the basal diet that corn and corn glutenmealwere replaced by 25%or 50%fusarium toxin contaminated-corn and contaminated-corn gluten meal，respectively.The results showed as follows：（1）The dietary starch decreased significantly along with the fermentation time（P＜0.05），and acetic acid and butyric acid were increased first and then decreased（P＜0.05）；（2）The starch and acetic acid of diet（0 d）decreased significantly with the elevated levels of fusarium toxins（P＜0.05）；（3）The starch，acetic acid and butyric acid parameters at the end of fermentation（18 d）had no difference among three treatments（P＞0.05）.Under the experimental conditions，the fermentation products of starch，acetic acid，and butyric acid of the compound feed were significantly affected by fusarium toxin and its levels.

fusarium toxin；fermentation products；starch；acetic acid；butyric acid

S816.3

A

1004-3314（2017）06-0030-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170607

山东省现代农业产业技术体系生猪项目（SDAIT-08-04）；山东省财政厅农业技术推广项目

*通讯作者