白术多糖对断奶仔猪白细胞介素-1β基因表达的影响

柴艳，李琦华，贾俊静，张文杰，陈涛，师正鹏，梁建平

（1.芒市科技局科协，云南德宏678400；2.云南农业大学动物科学学院，省动物营养与饲料科学重点实验室，云南昆明650201；3.潍坊六和饲料有限公司临朐分公司，山东潍坊262609；4.芒市畜牧局，云南德宏678400；5.德宏州畜牧局，云南德宏678400；6.德宏州科技局科协，云南德宏678400））

白术多糖对断奶仔猪白细胞介素-1β基因表达的影响

柴艳1，李琦华2*，贾俊静2，张文杰3，陈涛4，师正鹏5，梁建平6

（1.芒市科技局科协，云南德宏678400；2.云南农业大学动物科学学院，省动物营养与饲料科学重点实验室，云南昆明650201；3.潍坊六和饲料有限公司临朐分公司，山东潍坊262609；4.芒市畜牧局，云南德宏678400；5.德宏州畜牧局，云南德宏678400；6.德宏州科技局科协，云南德宏678400））

本试验选用44日龄、平均体重8.94 kg的DLY三元杂交断奶仔猪60头，随机分为5个处理组，每个处理3个重复，每个重复4头猪。第一组为对照组，饲喂基础日粮；第二、第三、第四和第五组为试验组，分别在基础日粮中添加抗生素（杆菌肽锌+硫酸粘杆菌素）及0.05%、0.10%、0.15%的白术多糖（PAM），正式期为30 d。30 d后颈静脉采取血液样品，并应用SYBR Green I荧光染料实时定量PCR方法进行白细胞介素-1β（IL-1β）基因mRNA的定量，研究白术多糖对断奶仔猪免疫功能的影响，为白术多糖的深入研究提供科学依据。结果表明：IL-β基因的相对表达量，各处理组间差异不显著（P＞0.05），但白术多糖处理组均比对照组和抗生素组高，其中以0.1%PAM组最高，抗生素组、0.05%PAM组次之，对照组和0.15%PAM处理组的最低。0.1%PAM处理组与对照组和抗生素组相比，IL-β基因相对表达量分别提高34.21%和27.5%；0.1%PAM处理组与0.05%PAM处理组和0.15%PAM处理组相比，IL-β基因相对表达量分别提高27.5%和34.21%。0.05%PAM处理组与对照组和抗生素组相比，IL-β基因相对表达量分别提高5.2%和0%；0.15%PAM处理组与对照组相比，IL-β基因相对表达量提高0%；0.15%PAM处理组与抗生素组相比，IL-β基因相对表达量降低5%。

断奶仔猪；白术多糖；白细胞介素-1β基因

白术多糖（PAM）是植物多糖中的一种，为菊科多年生草本植物，在我国的南方地区广泛种植，是中草药配方的一种有效成分，其用量居大宗常用中药材之首（Shiik等，2003；Prieto，2003；Gong等，2002；杨翠平等2002；黄青森，2001；Ronald，1996；Mori等，1989；Fenichel，1984）。研究表明，PAM具有以下作用：（1）提高淋巴细胞增殖和抗体的产生、提高细胞免疫功能（Huang等，2005；P rieto，2003；郭凤丽等，2003）。（2）提高细胞过氧化物歧化酶（SOD）活性，抑制红细胞自氧化溶血，直接清除自由基（吕圭源等，1996）。（3）增强家兔离体小肠平滑肌自发性收缩（马允慰，1982）；能明显促进小鼠小肠蛋白质的合成；对应激性溃疡，有显著抑制作用（马晓松等，1995）。（4）具有抗菌消炎作用，对伤寒杆菌、甲型副伤寒杆菌、福氏痢疾杆菌等有抑制作用。研究表明，PAM能使小鼠TH细胞明显增加，提高TH/Ts比值，改善T细胞亚群分布紊乱状态，使IL－2表达水平显著提高，并能增加T淋巴细胞表面IL－2R基因的表达。表明PAM可能是增强免疫和调节免疫作用的重要机制之一（余上才，1994）。（5）一定剂量的PAM能增加小鼠胸腺和脾脏重量，对抗环磷酰胺所致白细胞减少作用，增强腹腔巨噬细胞吞噬功能，并能促进T淋巴细胞转化和溶血素的生成（汤新慧，1998；李育浩等，1991）。（6）抗肿瘤作用（Mori等，1989）。此外，PAM还有抗血凝、扩张血管、防护放射线损害等作用，是国家中医管理局公布的中医防治“非典”处方中的重要药材之一（余上才，1994）。本文将PAM添加至早期断奶仔猪饲料中，研究其对断奶仔猪白细胞介素-1β基因表达效果的影响，旨在为PAM在饲料中的合理利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物从昆明和牧牧业有限公司猪场选择胎次、体重（7.5 kg左右）相近，健康状况良好的三元杂交（DLY）仔猪，公母各半，共60头，随机分为5组，每个处理12头，分为3个重复（栏），每个重复4头。

1.2 试验设计及日粮试验用白术多糖由华南农业大学提供，试验日粮原料由昆明云岭广大种禽饲料有限公司提供。白术多糖以3个不同剂量分别添加至饲料中。试验日粮组成和营养水平见表1。抗生素组中添加1∶5的硫酸粘杆菌素和杆菌肽锌，除抗生素组以外，其他试验组中均未添加任何药物和抗生素。

表2 基础日粮组成及营养水平

1.3 饲养管理饲养试验在统一条件下进行，试验猪按体重相近原则随机的分配到各个处理中，且全部饲养在同一栋朝向相同猪舍内。试验的前10 d，采用相同功率的红外灯人工补温，后20 d自然温度。试验前对猪舍进行统一清洗、消毒，试验猪用耳牌编号，同时按常规免疫程序免疫，并做好疾病控制。整个试验期采用自由采食和饮水。

1.4 PCR引物设计参照GenBank（http：//www. ncbi.nlm.nih.gov）公开发表的猪白细胞介素-1β基因全长序列和猪βactin核苷酸序列，运用Primer 5.0软件进行引物设计，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。其白细胞介素-1β和18S的产物长度分别为124和195 bp，引物序列如下：

IL-1β上游5'ACCTGGACCTTGGTTCTC 3'

IL-1β下游5'GGATTCTTCATCGGCTTC 3'

18S上游5'GCGGCTTTGGTGACTCTA 3'

18S下游5'CTGCCTCCTTGGATGTG 3'

1.5 白细胞介素-1β基因表达的检测饲养30 d后颈静脉采取血液样品，血样于-80℃冰箱保存，用RNA提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）提取血液RNA，应用SYBR Green I荧光染料实时定量PCR方法进行IL-1β基因mRNA的定量。

1.6 数据处理试验数据均采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 血液总RNA的提取使用百泰克（血液样本）总RNA快速提取试剂盒提取血液RNA，然后取7μL进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测结果如图1。提取的RNA无蛋白质污染，并且条带清晰，也没有降解和断裂，说明提取RNA达到试验要求。

图1 血液RNA提取电泳图

2.2 IL-β和18SPCR扩增图经RT-PCR得到目的基因片段如图2和图3。1%琼脂糖凝胶电泳图谱显示IL-β基因的目的片段大小为124 bp，18S的目的片段大小为195 bp，扩增产物的长度大小与目的片段大小一致。

图2 18S基因扩增电泳图

图3 猪IL-β基因扩增电泳图

2.3 测序结果经PCR扩增的IL-β基因胶回收后，产物送北京三博远志生物技术有限责任公司测序，测序结果经NCBI-BLAST程序比对，确认PCR扩增产物均为目的片段。其比对结果如下：

GENE ID：397122 IL1B|interleukin 1，beta [Sus scrofa]

（10 or fewer PubMed links）

Score=152 bits（82），Expect=1e-33

Identities=85/86（98%），Gaps=1/86（1%）

Strand=Plus/Minus

2.4 荧光定量PCR结果分析

2.4.1 IL-β基因荧光定量PCR结果以cDNA样品为模板进行定量PCR得到IL-β基因的荧光定量PCR扩增的动力学曲线（图4）和荧光定量PCR扩增的溶解曲线（图5）。

图4 部分样品IL-β基因的荧光定量PCR扩增动力学曲线

图5 部分样品IL-β基因的荧光定量PCR扩增熔解曲线

2.4.2 IL-β基因标准曲线的绘制将目的基因片段回收纯化后，按相差10倍的比例做5～8个浓度梯度稀释，作为荧光定量PCR标准模板，进行定量反应。在标准曲线图中，Ct值与模板扩增拷贝数的对数呈反比关系。

标准曲线图中基因的扩增效率一般为80%～105%，相关系数一般大于0.98，即认为定量可靠。本试验中IL-β基因标准曲线的扩增效率及其相关系数分别为82%和99.8%。如图6即认为达到荧光定量PCR的扩增要求。

图6 IL-β标准品荧光定量PCR反应的标准曲线

2.4.3 IL-β实时荧光定量PCR产物检测经实时荧光定量PCR得到目的基因片段，经1%琼脂糖凝胶电泳图谱显示IL-β目的片段大小为124 bp左右，与预期结果相符。在电泳过程中没有出现非特异性条带，且带型完整，亮度适中。说明荧光定量PCR反应体系和条件设置比较合适，扩增效果良好，定量结果可靠。

2.4.4 18S基因荧光定量PCR结果以血液cDNA样品为模板进行定量PCR得到18S基因的荧光定量PCR扩增的动力学曲线（7图）和荧光定量PCR扩增的熔解曲线（图8）。

图7 部分样品18S基因的荧光定量PCR扩增的动力学曲线

图7 的动力学曲线图表明样品的RNA完整性好。图8的熔解曲线分析显示，引物二聚体污染较少，熔解温度均一，峰的形状较尖锐，表明定量结果比较准确。

2.4.5 18S基因标准曲线的绘制18S基因标准曲线图中该基因的扩增效率为84.1%，相关系数为0.998（见图9），达到荧光定量PCR的扩增要求。

图8 部分样品18S基因的荧光定量PCR扩增熔解曲线

图9 18S标准品荧光定量PCR反应的标准曲线

2.4.6 不同白术多糖添加水平对仔猪IL-β基因相对表达量的影响由表3可知，在仔猪基础日粮中添加白术多糖可以提高断奶仔猪IL-β基因的相对表达量，剂量不同IL-β基因的相对表达量不同，白术多糖处理组的IL-β基因相对表达量都比对照组和抗生素组高，但添加PAM组之间差异不显著（P＞0.05），其中以0.1%添加量组相对比较高。另外，0.1%PAM处理组与对照组和抗生素组相比，IL-β基因相对表达量分别高出34.21%和27.5%；0.1%PAM处理组与0.05%PAM处理组和0.15%PAM处理组相比，分别高出27.5%和34.21%。0.05%PAM处理组与对照组相比，IL-β基因相对表达量高出5.2%；0.15%PAM处理组与抗生素组相比，IL-β基因相对表达量降低5%。

3 讨论

淋巴细胞可产生大量的细胞因子，其中产生的IL-1β被认为是主要的前炎症因子（杨文东等，2007）。

表3 不同白术多糖添加水平仔猪IL-β基因相对表达量的比较分析

近年来，多糖对淋巴细胞增殖的影响已有许多报道，研究表明，大多数多糖在体内或体外均能促进淋巴细胞的转化。例如黄芪多糖（胡庭俊等，2005）、蜂胶多糖（王德云等，2005）、当归多糖（胡庭俊等，2005）均能促进畜禽淋巴细胞增殖。汤新慧（1998）研究发现，白术多糖能明显促进淋巴细胞向成熟T淋巴细胞转化。Guo（2000）报道，从紫云英中提取的果胶多糖，可促进体外培养的鼠B细胞IL-6的分泌，其机制是IL-6 mRNA转录活性增加。胡晓蕾（2006）报道，添加1%和2%白术多糖均可显著提高鼠的免疫功能，但二者的效果差异不显著；而0.5%白术添加组与对照组相比无明显的免疫促进作用。可能原因是0.5%白术添加量太小，以致对大鼠脾脏系数和胸腺系数无明显的促进作用，甚至有降低的趋势。

本试验结果表明，在断奶仔猪日粮中添加0.1%的白术多糖可以提高仔猪IL-1β的表达量，添加量为0.15%和0.05%时，仔猪IL-1β的表达量与对照组和抗生素组无显著差异。

本研究中IL-1β的相对表达量结果与其他报道结果有不相一致的地方，这可能与选择多糖的种类、来源、有效成分的含量、添加量、日粮组成、试验条件、试验动物等有关，具体情况有待进一步研究。

[1]郭凤丽，邱世翠，王志强等.白术对小鼠淋巴细胞增殖、IL-2和抗体产生的影响[J]，中国中医药科技，2003，10（3）：85～86.

[2]胡庭俊，程富胜，陈炅然，等.黄芪多糖对小鼠免疫细胞信号转导相关分子的影[J].畜牧兽医学报，2005，36（6），616～619.

[3]胡晓蕾，胡迎利，汪以真.白术及白术多糖对SD大鼠生长性能和免疫功能的影响[J].中国兽药杂志.2006，40（1）：2~6.

[4]黄青森.湖南主要地产中药材销售趋势分析[J].中药研究与信息，2001，3（12）：29～30.

[5]吕圭源，李万里.白术抗衰老作用研究[J].现代应用药学，1996，13（5）：26～29.

[6]李育浩，梁颂名，山原绦二，等.白术对胃肠功能的影响[J].中药材，1991，14（9）：38.

[7]马允慰.白术对家兔离体肠管活动的影响[J].中成药研究，1982，12：26.

[8]马晓松，樊雪萍，邢治善.白术促进小鼠胃肠蠕动的探讨[J].中国医院药学杂志，1995，15（4）：167.

[9]汤新慧.白术多糖对小鼠免疫功能的影响[J].中医研究，1998，1l（2）：7～9.

[10]王德云，胡元亮，孔祥峰，等.中药成分对培养的鸡脾脏淋巴细胞增殖的影响[J]畜牧兽医学报，2005，36（11）120～121.

[11]余上才.枸祀子和白术免疫调节作用的实验研究[J].上海免疫学杂志，1994，14（1）：12.

[12]杨文东，李志新.IL-1βmRNA和TNFotmR N A在慢性根尖周病损组织中的表达[J].牙体牙髓牙周病学杂志，2007，17（4）187～189.

[13]杨翠平，劳业兴，吴凤薇，等.白术的研究进展[J].中药材，2002，25（3）：206～208.

[14]Fenichel R L.Immue modultion agents and their mechanism[M].New York：M arcel dekker Inc，1984.400.

[15]Gong J H，Forster R J，Yu H，et al.M olecular analysis of bacterial populations in the ileum of broiler chickens and comparison w ith bacteria in the cecum[J].FEMSM icrobiology Ecology，2002，41：171～179.

[16]Guo Y，Matsumoto T，KikuchiY，et al.Eliects of a pectic polysac-Charide from a medicinal herb，the roots of Bupleurum falcatum L.on interleukin 6 production of murine B cells and B cell lines[J].Immunophmacoloogy，2000，49（3）：307～3 1 6.

[17]Huang H L，Chen C C，Yeh C Y，et al.Reactive oxygen species mediation of Baizhu-inducedapoptosis in leukem ia cells[J].Journal of Ethnopharmacology，2005，97（1）：21～29.

[18]M ori H，Xu Q，Sakamoto O，et al.Mechanisms of antitumor activity of aqueous extracts from Chinese herbs and their immunopharmacology properties[J].Japanese Journal of Pharmacology，1989，49（3）：423～432.

[19]Prieto JM，Recio M C，Giner R M，et al.Influence of traditional Chinese medicinal plants on leukocyte and platelet functions.[J]Journal of Pharmacy. and Pharmacology，2003，55（9）：1275～1282.

[20]Ronald L C.Passive transfer of poly（1，6）-Glucotriosyl-（1-3）-Glucopyranose glucan protection against lethal infection intra-abdom inal sepsis [J].Infection and immunity，1996：64（6）：2201～2205.

[21]Shiik，Takii S.Comparison of microbial communities in four different composting processes as evaluated by denaturing gradient gel electrophpresis analysis[J].Journalof Applied M icrobiology，2003，95：109～119.

A total fo 60 three-line crossbred DLY（44 days old）early-weaned piglets（average weight is about 8.94 kg）were random ly assigned to 5 treatments with 3 replicates of 4 pigs.GroupⅠfeed basal diet（CK），groupⅡfeed with antibiotic（bacitracin zinc+polymyxin E），groupⅢ，IV，V were fed with 0.05%，0.10%，0.15%Atractylodesmacrophala Koidz（PAM）.This experiment had one phases，total of 30 days，after 30 days，adopts the blood sample from neck meridians.And IL-1βgenemRNA wasmeasured by SYBR Green IFluorescent dye Real-time quantitative PCR to study the effect of immune function in piglets，and provid scientific proof for the future research of PAM.The results showed as follows：the experimental groups did not show significant difference on IL-1βgene mRNA（P＞0.05）.But natural PAM groupswere higher than control group and antibiotic group.Among them，0.1%PAM group was highest，0.05%PAM group and antibiotic group were second，control group and 0.05%PAM group were lowest.Compared with the control group and antibiotic group，the relative expression of IL-1βgene in 0.1%natural PAM group were higher 34.21%and 27.5%respectively；Compared with 0.05%natural PAM group and 0.15%natural PAM group，the relative expression of IL-1βgene in 0.1%natural PAM group were higher 27.5%and 34.2%respectively；Compared with the control group and antibiotic group，the relative expression of IL-1βgene in 0.05%natural PAM group were higher 5.2%and 0%respectively；Compared with the control group，the relative expression of IL-1βgene in 0.15%natural PAM group was higher 0%；Compared with antibiotic group，the relative expression of IL-1βgene in 0.15%natural PAM group was lower 5%.

weaned-piglet；polysaccharides of Atractylodesmacrophala Koidz；IL-1βgene

S816.7

A

1004-3314（2017）06-0010-05

云南省运用基础研究面上基金项目（2007C0056M）

*通讯作者