Hematoflow技术用于白血病筛查及化疗疗效监测临床价值

何一波刘永林李晓芳施丽华彭来君杨正东陈益民

Hematoflow技术用于白血病筛查及化疗疗效监测临床价值

何一波1刘永林2李晓芳2施丽华2彭来君2杨正东1陈益民2

目的探讨Hematoflow技术在筛查早期白血病及监测化疗疗效的临床应用价值。方法收集血液科门诊及住院患者342例共计455份EDTA-K2抗凝的外周血样本，应用血细胞分析仪、形态学镜检、Hematoflow分类计数外周血白细胞，计算其相关性；以形态学镜检法为金标准，评价Hematoflow分类计数原始细胞的特异性和灵敏度;形态学镜检计数14例初发白血病化疗前后的骨髓原始细胞，观察与Hematoflow计数外周血原始细胞的相关性。结果与形态学镜检法相比，Hematoflow、血细胞分析仪分类计数中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞呈现明显正相关（r=0.821、0.863、0.845、0.690，0.703、0.882、0.802、0.475，P<0.05）；以形态学镜检法为金标准，原始细胞≥1%为临界值，Hematoflow法检出原始细胞的灵敏度为100%，特异性为97.3%，准确度为97.8%；急性白血病患者化疗前后骨髓原始细胞的变化值与Hematoflow计数外周血原始细胞的变化值呈正相关（r=0.704，P<0.01）。结论Hematoflow分类计数外周血白细胞准确、可靠，检测原始细胞方法学快速、特异、灵敏、自动化，尤其对低白细胞总数的样本，在白血病筛查及疗效监测中具有较高的临床应用价值。

白血病；白细胞分类计数；Hematoflow技术；流式细胞术；血细胞形态学

白血病是一种临床常见的恶性肿瘤疾病，目前对其早期筛查主要根据外周血白细胞分类计数[1]。血细胞分析仪和形态学镜检法是用于外周血白细胞分类计数最常见的两类方法，前者可标准化、自动化，但识别异常白细胞的能力较低[2-5]；后者作为“金标准”，但易受主观因素的影响，结果提供信息较少，需要技术娴熟的专业人士操作，不能广泛应用[6-9]。近年来，欧美一种基于cytodiff试剂的快速流式细胞术Hematoflow的出现可弥补这些不足，同时能分类更多白细胞亚群[10-11]，主要应用于败血症、中性粒细胞减少症等疾病诊断及异常白细胞的筛查等[11-13]。目前国内相关报道甚少[14]。本研究通过Hematoflow、形态学镜检和血细胞分析仪法分析342例血液病患者455份外周血样本，对白细胞分类结果进行比较，验证Hematoflow技术分类计数外周血白细胞尤其是原始细胞的的可靠性，同时探讨其在白血病的筛查及疗效监测的临床价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象入选病例为2014年7—11月浙江中医药大学附属第一医院血液科门诊及住院患者共342例，其中急性白血病（AL）72例，慢性白血病（CL）47例，骨髓增生异常综合征（MDS）48例，多发性骨髓瘤（MM）38例，恶性淋巴瘤（ML）58例，其他血液病79例，诊断标准根据张之南《血液病诊断及疗效标准》[15]。男176例，年龄4～87岁，中位年龄51岁；女166例，年龄1～89岁，中位年龄52岁。

1.2 仪器与试剂LH750全自动血细胞分析仪（美国Beckman公司），FC500流式细胞仪（美国Beckman公司），血细胞分析配套试剂和质控物、稀释液（COULTERCLEZ@DILUENT）、清洗液（COULTERCLENZ）、Cytodiff组合试剂、溶血素、校准微球（Flow-SetPro）和质控微球（Flow-Check Pro、Flow-Check）均购自美国Beckman公司。

1.3 手工分类计数由两名具有3年以上细胞形态学工作经验的检验师操作，制片后计数200个白细胞，如果样本细胞数不足200个，则计数全片白细胞，如手工法未检测到原始细胞而用Hematoflow技术检测到原始细胞或白细胞总数低于0.5×109/L，则由两名高年资（10年以上）具备形态学经验的检验师复核。

1.4 血细胞分析仪分类计数应用全自动血细胞分析仪（LH750）测定样本，测定样本前使用配套质控物进行室内质控以保证检测结果的可靠性和稳定性，存贮全血细胞计数和WBC分类计数的结果。仪器报警为“原始细胞”或“异常淋巴细胞”的样本依旧纳入此研究。

1.5 Hematoflow分类计数操作参考厂商的说明书，将Cytodiff组合试剂10μL与全血100μL混匀，室温避光孵育15～20min，加入溶血素1mL混匀，室温避光孵育15min，上机。流式细胞仪开机后先使用Flow-Check上机测试，观察荧光强度FL1-FL5的变异系数（CV）在要求范围内，如符合要求可检测样本。将样本放入32管进样转盘中，打开自动分析软件，调整设门策略，设门策略参考说明书，根据外周血中各种白细胞表面抗原表达类型不同及荧光强度的差异，结合不同细胞光散射特点采用多重逻辑设门的方法将其分开。

1.6 骨髓形态学与外周血Hematoflow结果的一致性收集14例急性白血病患者首次就诊骨髓常规结果，同时收集患者骨髓穿刺当天外周血样本行Hematoflow检测。常规化疗后3～4个月，复检骨髓常规及外周血Hematoflow分析。

1.7 统计学方法应用SPSS17.0软件进行统计分析。对三种分类计数法分别做双变量Pearson相关性分析。率的比较用配对四格表资料的χ2检验，双变量对比应用配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hematoflow、形态学镜检、全自动血细胞分析仪用于外周血白细胞分类计数相关性分析与形态学镜检法相比，计数中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞，Hematoflow法、血细胞分析仪法均呈现明显正相关（P<0.05）；计数嗜碱性粒细胞，Hemato-flow法呈正相关，而血细胞分析仪法无明显相关性；计数原始细胞，Hematoflow法呈高度相关（r= 0.953，P<0.05），见表1。

表1 Hematoflow法、血细胞分析仪法（Y）与形态学镜检法（X）相关性分析

2.2 Hematoflow技术检测外周血原始细胞的灵敏度和特异性以原始细胞≥1%为临界值，形态学镜检为标准，455例样本共检出86例原始细胞，阳性率18.9%；Hematoflow检出原始细胞96例，敏感度为100%，特异性97.3%，准确度为97.8%。见表2。Hematoflow发现原始细胞而形态学镜检未能发现共有10例样本，经两名高年资（10年以上）医师复核，证实其中有7例样本有原始细胞，另有3例为成熟淋巴细胞。形态学镜检漏检的7例样本有5例细胞数低于0.5×109/L，另2例原始细胞比例分别为2%、3%，提示Hematoflow技术在白细胞缺乏症患者中发现原始细胞有很高的价值，尤其在原始细胞比例较低的情况下更优于一般的形态学镜检。

2.350 例WBC<0.5×109/L样本Hematoflow法、手工镜检法检测原始细胞比较以原始细胞≥1%为临界值，形态学镜检为“金标准”，50例WBC<0.5×109/L样本中共检出原始细胞19例，用Hematoflow法共检出20例，灵敏度100%，特异性96.78%；手工法共检出14例，灵敏度73.68%，特异性100%。

2.4 Hematoflow技术在评估白血病化疗疗效中的作用对14例急性白血病患者化疗前后行骨髓常规及外周血Hematoflow分析，见表3。化疗前后骨髓原始细胞变化值与Hematoflow法检测外周血原始细胞变化值呈正相关（r=0.704，P<0.01），见图1。

表2 Hematoflow法检测外周血原始细胞灵敏度及特异性分析（例）

3 讨论

图1 白血病患者化疗前后骨髓、外周血原始细胞变化值的相关性

Hematoflow技术主要用于外周血白细胞分类计数，可对白细胞进行16亚群分型，对原始细胞及不成熟中性粒细胞有较高的诊断效率，但国内相关报道很少。本研究通过Hematoflow、手工镜检、血细胞分析仪法分别对455例外周血白细胞进行分类计数后发现，三种方法检测结果呈明显的正相关，与手工镜检法相比，Hematoflow技术较血细胞分析仪在各类白细胞分类中相关性更显著，尤其原始细胞（r= 0.953，P<0.01），提示Hematoflow在发现异常白细胞中的作用，这与Jo等[11]报道的结论一致。由于手工镜检操作繁琐、不易自动化，Hematoflow可弥补这方面的不足，这也使得Hematoflow技术在白血病的筛查方面有着无限应用的前景。在三种方法的比对中，本研究发现对嗜碱性粒细胞分类，血细胞分析仪法与手工镜检法相比无明显相关；尽管Hematoflow法结果有相关性，但相关性较弱（r=0.445，P<0.05），可能与外周血嗜碱性白细胞数量少、比例低有关。

表3 14例急性白血病患者化疗前后Hematoflow及骨髓常规结果

以原始细胞≥1%为临界值，本研究中455例样本形态学镜检共检出86例原始细胞，Hematoflow法检出原始细胞96例，灵敏度为100%。对于该结果，推测形态学镜检法可能难以计数到足够的细胞数，且白细胞形态异常明显，聚集情况严重，分类难度高，容易造成原始细胞漏检及误判；而Hematoflow技术是基于细胞免疫标志进行的，在不降低灵敏度的前提下增加对白细胞识别的特异性，并能识别出难以辨认的原始细胞和幼稚细胞。Hematoflow法错误分类的3例样本均为慢性淋巴细胞白血病患者，原因可能与淋巴细胞CD45表达异常减弱有关，导致CD45 V SS双参数图中淋巴细胞群左移，被错误分类为原始细胞。

骨髓常规检查是应用于血液系统疾病尤其是白血病的重要检查项目，其原始细胞数目的变化可以很大程度上反映患者的病程发展，但骨髓常规检查具有创伤性且有诸多禁忌证，无法短期内多次检测。本研究显示化疗前后骨髓原始细胞变化值与外周血Hematoflow检测的原始细胞变化呈正相关，提示白血病患者外周血Hematoflow技术检测可作为骨髓检查的一种补充检验手段，可适当地减少骨髓穿刺的次数，用于化疗疗效监测，但本次研究样本数有限仍有待进一步研究证实。

总之，Hematoflow技术用于分类计数外周血白细胞稳定可靠，检测原始细胞方法学快速、特异、灵敏度高，且对白细胞减少的标本具有更高的诊断效率，在白血病筛查及疗效监测具有较高的临床应用价值，在值得进一步推广和应用。

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（收稿：2016-11-10修回：2017-01-13）

Clinical Application of Hematoflow Method to Screening Leukemia and Monitoring Efficacy of Chemotherapy

HE Yibo1,LIU Yonglin2,LI Xiaofang2,SHI Lihua2,PENG Laijun2,YANG Zhengdong1,CHEN Yinmin2.
1 The First Clinical Medical College,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310002),China;2 Clinical Laboratory,the First Hosptial Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006)

ObjectiveTo investigate the clinical application of Hematoflow method to screening leukemia and monitoring the effect of chemotherapy.MethodsA total of 455 peripheral blood samples through EDTA-K2 anticoagulation from 342 inpatients and outpatients in Department of Hematology were collected in this study.Leukocytes in these samples were counted with automated hematology analyzer,morphology observation and Hematoflow method,separately,then the correlation among these results was calculated.The specificity and sensibility of Hematoflow method were analyzed and compared to morphology observation as a reference method.Blast cells from 14 patientswith primary leukemia before and after chemotherapy were collected to make a comparison with Hematoflow method.ResultsThe correlation between Hematoflow method,hematology analyzer and morphological observation was good for neutrophils,lymphocytes,monocytes,basophils and eosinophils（r=0.821,0.863,0.845, 0.690,0.703,0.882,0.802,0.473,P<0.05）.When the cutoff value of blast count by Hematoflow method was set at 1%,the sensitivity was 100%,the specificity was 97.3%,and the accuracy was 97.8%,referred to morphological observation（P<0.05）.The correlation between Hematoflow method and bone marrow examination for blasts variation was good in 14 patients undergoing chemotherapy（r=0.704,P<0.01）.ConclusionHematoflow method is accurate and available for leukocyte differential count and has high sensitivity and specificity for blasts differential count, especiallyhaving excellent diagnostic efficiency in the sample of leukopenia.

leukocyte;WBC differential count;Hematoflow method;flow cytometry;morphology

国家中医药管理局科研基金（No.JDZX2015111）

1浙江中医药大学第一临床医学院（杭州310002）；2浙江中医药大学附属第一医院检验科（杭州310006）

陈益民，Tel：13906533683；E-mail：cym3338@163com