养正消积胶囊对荷MFC胃癌小鼠调节性T细胞的影响

周群琴 张爱琴 陈莎莎 钱祥

·论著·

养正消积胶囊对荷MFC胃癌小鼠调节性T细胞的影响

周群琴1张爱琴2陈莎莎3钱祥2

目的探讨养正消积胶囊对荷MFC胃癌小鼠的疗效及免疫调节机制。方法雄性615小鼠50只，皮下接种法建立小鼠胃癌肿瘤模型，随机分为模型组、养正消积胶囊组、5-氟脲密啶（5FU）组、联合组，每组各10只，另设正常组10只。观察荷MFC胃癌小鼠移植瘤生长情况以及体质量等的变化。于末次给药后完整剥取移植瘤、胸腺、脾脏并称重，计算各组荷MFC胃癌小鼠移植瘤体积和抑瘤率。流式细胞仪测定外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例。结果（1）模型组、联合组、养正消积胶囊组、5FU组小鼠瘤重分别为（4.46±0.89）g、（2.21±0.27）g、（3.50±0.42）g、（3.30± 0.41）g，与模型组瘤重比较，联合组、养正消积胶囊组、5FU组抑瘤率分别为50.92%、22.29%、25.89%，差异均有统计学意义（P<0.05）。（2）联合组、养正消积胶囊组小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例分别为（4.73±0.35）%、（5.43±0.47）%，均低于模型组的（7.26±1.12）%，差异有统计学意义（P<0.05）。结论养正消积胶囊具有抗MFC胃癌移植小鼠肿瘤生长的作用，该作用可能与其下调CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达相关。

小鼠；胃癌；养正消积胶囊；调节性T细胞

胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤。现代医学认为，胃癌的发生与机体的免疫状态密切相关，肿瘤细胞能够逃逸机体免疫系统的监视和杀伤，从而导致肿瘤的发生、发展、转移和复发。从免疫逃逸角度探索胃癌治疗的新方法成为近年来研究的热点。养正消积胶囊是国药准字号（Z20040095）抗癌中成药，已被证实对实体瘤有抗癌作用，并可以调节机体免疫功能，但其机制尚不明确。本课题旨在通过观察养正消积胶囊抗MFC胃癌荷瘤小鼠移植瘤生长，及对荷瘤小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例的影响，探讨该方调节抗肿瘤免疫的机制，为该方临床应用提供更多的实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株与实验动物小鼠MFC前胃癌细胞株购自中国科学院上海细胞库。细胞于浙江省医学科学院中心实验室细胞室培养传代。SPF级雄性615小鼠50只，体质量（20±2）g，购自中国医学科学院血液病研究所，合格证号：SCXR（津）2009-0002。由浙江省医学科学院动物实验中心代为饲养。

1.2 药品与试剂仪器养正消积胶囊粉末购自石家庄以岭药业股份有限公司；5-氟脲密啶（5FU）购自天津金耀药业有限公司；抗小鼠CD4-FITC，购自美国BD公司，批号5027567；抗小鼠CD25-APC，购自美国BD公司；抗小鼠Foxp3-PE，购自美国BD公司；FBS，购自美国BD公司；Mouse Foxp3 Buffer set（Permeabi1izationConcentrate、FixationConcentrate），购自美国BD公司；红细胞裂解液美国BD公司，批号5075567；流式细胞仪：购自美国贝克曼库尔特公司。

1.3 动物分组与给药含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下传代培养，最终将细胞悬液稀释为5×106/mL的浓度备用。用随机数字表法选出10只615小鼠为正常组，余40只615小鼠每只按每只0.2mL在每只小鼠右前肢腋窝处皮下接种以造模，造模后再按随机数字表法分为模型组、养正消积胶囊组、5FU组、联合组，每组10只。全部615小鼠饲养在SPF环境中。养正消积胶囊每粒0.39g，成人用量1天3次，每次4粒，按《中药药理研究方法学》用量折算法，计算得小鼠每日用量为0.01g。5FU注射液，每只小鼠按20mg/kg隔日腹腔注射给药。养正消积胶囊组、联合组每天予养正消积胶囊药液0.2mL灌胃，5FU组、联合组隔天予5FU药液0.2mL腹腔注射。给药时间从造模后第1天起至第15天。正常组和模型组不予处理。

1.4 观察成瘤率、肿瘤体积、体质量、平均瘤重、胸腺重、脾脏重自接种第3天开始，经造模的各组小鼠右前肢腋窝皮下均触及小米粒样肿块，成瘤率100%。自造模起，每天称小鼠体质量。自接种第6天开始，每3天用游标卡尺测量移植瘤最长径L（mm）和垂直方向的最大横径W（mm），计算移植瘤体积[V（mm3）=L×W2/2]。在停药24h后，用摘眼球采血法留取五组小鼠血液，而后脊髓脱臼处死小鼠，完整剥离移植瘤、胸腺、脾脏并称重，计算抑瘤率，抑瘤率（%）=（1-给药组平均瘤重/模型组平均瘤重）×100%。

1.5 流式细胞术检测小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例向200μL肝素抗凝血中加入2mL红细胞裂解液，用FBS将裂解红细胞后的细胞稀释至1×107个/mL；将20μL CD4-FITC与CD25-APC加入流式管底部，再加入100μL稀释好的细胞，混匀，室温避光孵育20min；加入2mLFBS，250×g离心10min，弃上清；加入2mL Fixation Buffer，混匀，4℃避光孵育30min；500×g离心5min，弃上清；加入2mL Permeabilization buffer，500×g离心5min，弃上清；再加入2mL Fixation Buffer，37℃避光孵育30min；500×g离心5min，弃上清；加入2mL FBS，500×g离心5min，弃上清；加入20μL抗小鼠Foxp3-PE，混匀，室温避光孵育20min；加入2mL FBS，500×g离心5min，弃上清；再加入2mL FBS，500×g离心5min，弃上清；加入500μL FBS重悬细胞，上机检测，以CD4+T设门，检测CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例。

1.6 统计学方法应用SPSS Statistics 17.0软件。计量资料用均数和标准差（）表示，多组间比较用单因素方差分析（one-way ANOVA），方差齐性时多组间两两比较用最小极差法（LSD法），方差不齐时多组间两两比较用Dunnett's T3法，任意两组比较采用独立样本t检验。检验水准取α=0.05，P<0.05，表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠体质量、移植瘤体积、肿瘤抑制率比较5FU组小鼠体质量增加较少，其余各组小鼠生长状态稍好，明显优于5FU组，但差异无统计学意义（P>0.05），见表1。各组小鼠移植瘤体积逐渐增大，其中模型组小鼠移植瘤体积增长较快，各用药组移植瘤增长相对缓慢，其中联合组增长最为缓慢，与模型组比较差异均有统计学意义（P<0.05），见图1。各用药组瘤重均低于模型组，其中养正消积胶囊组、5FU组与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05），联合组与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01），养正消积胶囊组与5FU组比较，差异无统计学意义（P> 0.05），见表2。

图1 各组MFC胃癌荷瘤小鼠移植瘤生长曲线

表1 各组小鼠体质量变化情况（g，）

表1 各组小鼠体质量变化情况（g，）

组别正常组5FU组模型组养正消积胶囊组联合组鼠数10 10 10 10 10初体质量20.30±0.94 20.11±0.71 19.26±0.62 20.07±0.82 20.20±0.89末体质量31.23±1.35 30.08±1.99 29.20±2.77 29.74±1.72 31.35±0.95体质量变化11.2±0.94 9.94±1.95 9.64±1.47 10.97±1.07 11.15±0.81

表2 各组荷MFC胃癌小鼠移植瘤抑制率情况

表2 各组荷MFC胃癌小鼠移植瘤抑制率情况

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

组别模型组养正消积胶囊组5FU组联合组鼠数10 10 10 10瘤重（g）4.46±0.89 3.50±0.42* 3.30±0.41* 2.21±0.27**抑瘤率（%）－22.29 25.89 50.92

2.2 各组小鼠胸腺、脾脏重量比较与正常对照组比较，各组小鼠胸腺的重量差异无统计学意义（P> 0.05）；与正常对照组比较，模型组小鼠脾脏重量增大，差异有统计学意义（P<0.05），养正消积胶囊组和与联合组干预后脾重接近正常水平（P<0.05），见表3。

表3 小鼠脾脏和胸腺重量比较（mg）

表3 小鼠脾脏和胸腺重量比较（mg）

注：与正常组比较，#P<0.01；与模型组比较，*P<0.05

组别正常组模型组5FU组养正消积胶囊组联合组鼠数10 10 10 10 10脾重127.70±9.096 221.56±41.69#211.36±52.58 146.85±19.31* 143.31±21.33*胸腺重62.33±4.08 67.79±8.64 66.20±6.27 64.55±4.39 63.45±3.89

2.3 各组小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例与正常组相比，模型组小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg比例明显升高，差异有统计学意义（P< 0.05）；与模型组相比，荷胃癌小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例经养正消积胶囊单药和与5FU联合给药干预后下降，差异均有统计学意义（P< 0.05）；经5FU单药干预后，小鼠外周血Treg细胞比例有所升高，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例流式图，见图2。

表4 各组小鼠Treg细胞比例比较（）

表4 各组小鼠Treg细胞比例比较（）

注：与正常组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05

组别正常组模型组5FU组养正消积胶囊组联合组鼠数10 10 10 10 10 Treg细胞比例（%）3.26±0.38 7.26±1.12#7.69±1.79 5.43±0.47* 4.73±0.35*

图2 各组MFC胃癌荷瘤小鼠外周血Treg细胞比例流式图

3 讨论

《临证指南医案》曰：“经几年宿病，病必在络”。故而胃癌当属“络病”范畴。其根本原因是由于脾胃亏虚，脏腑功能失调，加之长期的饮食不节，情志失调，劳倦内伤，或感受外邪，导致脾胃功能受损，运化失常，精气失充，络气亏虚，虚而留滞，形成痰凝热毒血瘀等病理产物，继而阻塞络脉，胶结蕴阻于胃络，积聚成积。养正消积胶囊是在中医络病理论指导下研制而成，是运用络病理论分析胃癌的病机与治疗方法的成药。方中黄芪、女贞子、人参、灵芝、茯苓、炒白术健脾补肾，土蟞虫、莪术、鸡内金散结通络，白花蛇舌草、半枝莲、绞股蓝、蛇莓、白英、茵陈蒿、徐长卿解毒抗癌。其组方原则与中医对该病的治疗方法基本一致，均以健脾益肾为本，以充养精气，濡养络脉，调畅气机；以祛瘀散结通络，清热解毒散结为辅，使瘀祛络通积自消，从而发挥“养正积自除”之功。

本研究结果显示，模型组、5FU组小鼠体质量与其他各用药组相比呈下降趋势，而养正消积胶囊组荷瘤小鼠体质量较好，联合组最佳；养正消积胶囊组和联合组荷瘤小鼠脾脏重量及Treg细胞比例低于模型组，其中联合组最低，但均高于正常组；养正消积胶囊组、5FU组、联合组抑瘤率分别为22.29%、25.89%、50.92%；结合已有研究报道，可以认为，养正消积胶囊可以增强机体免疫功能，提高患者生活质量，抑制肿瘤的生长，与化疗联合给药效果更佳[1-2]。

CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞是一类免疫抑制性细胞，在维持外周免疫稳态中发挥至关重要的作用，既可以通过防止免疫系统对外来和自身抗原的免疫应答来维持对自身成分耐受，又可以通过阻止机体对肿瘤的免疫应答，从而导致肿瘤细胞的免疫逃逸[3-5]。在胃癌小鼠模型中，随着胃癌的进展，Treg细胞比例呈增高趋势；应用Treg细胞可以促进小鼠移植瘤的生长，降低胃癌细胞的凋亡；应用Treg细胞拮抗剂Anti-GITR则可以增强小鼠机体的抗胃癌作用[6]。机体内天然生成的CD4+CD25+Foxp3+Treg是从胸腺中直接发育而来，通过“另类阴性选择”过程[7]接受某种信号从而获得免疫抑制能力，故胸腺内环境保持相对稳定；而脾脏是外周免疫器官，经特异性抗原或免疫抑制因子的刺激如肿瘤、药物等使机体发生免疫反应，诱导生成具有免疫抑制活性的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞，解剖时可见模型组和各用药组小鼠脾脏均不同程度变黑肿大。临床研究发现，胃癌患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数量较健康志愿者高，且其细胞数与临床分期及淋巴结转移情况关系密切，其数量变化可以反应胃癌患者荷瘤状态[8]。并且，在肿瘤局部聚集着比正常组织更多的各类免疫细胞，而对胃癌预后有影响的是肿瘤局部组织中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的浸润情况，它可以作为胃癌免疫治疗的靶点[9]。Ahonen等[10]在研制多因子移植瘤疫苗（CD40和TLR促效剂）中，就将移植瘤组织中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的减少数量作为评价其效果的指标。越来越多的证据表明，癌症患者CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞增多，并且大量的Treg细胞导致了患者的低存活率[11-12]，而针对靶向Treg的治疗有望提高宿主抗肿瘤免疫应答。本研究结果显示，荷瘤机体内CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞呈高表达状态，可能和肿瘤的发展密切相关，而养正消积胶囊组及联合组Treg细胞比例增长缓慢，说明养正消积胶囊可以抑制移植瘤的生长，其机制可能和抑制Treg细胞的转化而发挥其免疫调节功能作用有关。

本研究结果显示，养正消积胶囊及养正消积胶囊与5FU联合给药有抑制Treg细胞表达的作用，近期疗效显著，但远期疗效还需深入研究。

［1］崔兴俊，洪艳艳，毕学杰，等.养正消积胶囊对胃癌组织PCNA，p53蛋白，VEGF表达的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（22）：304-306.

［2］惠文涛，昝瑛，马小斌，马一楠.胃癌根治术后养正消积胶囊联合ZELOX方案化疗对患者生存质量及免疫功能的影响［J］.现代肿瘤医学，2015，23（18）：2624-2627.

［3］宋彦，朱喜科.肿瘤免疫逃逸机制的研究新进展［J］.现代肿瘤医学，2011，19（6）：1230-1234.

［4］龚晓成，曾辉，韩伟.胃癌患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞55例分析［J］.癌症，2013，6（5）：38-40.

［5］张燕.肿瘤免疫治疗中CTL细胞、Treg细胞及其相关性研究［D］.石家庄：河北医科大学，2011：14-16.

［6］曾冬竹，余佩武.CD4+CD25+调控T细胞对小鼠胃癌的影响［J］.中华胃肠外科杂志，2007，10（4）：368-371.

［7］付泽娴，蔡建辉.CD4+CD25+调节性T细胞在肿瘤免疫治疗中的价值及应用前景［J］.中国全科医学，2005，21（8）：1799-180.

［8］卢芩，俞婷，张有珍，等.胃癌患者外周血及癌组织中调节性T细胞和Foxp3的表达意义［J］.中国老年学杂志，2014，34（7）：5140-5142.

［9］高铭，李济宇，欧敬民，等.胃癌局部微环境中细胞免疫功能状况与预后的关系［J］.中华临床医师杂志（电子版），2013，7（24）：11272-11276.

［10］Ahonen CL，Wasiuk A，Fuse S，et al.Enhanced efficacy and reduced toxicity of multifac torial adjuvants compared to unitary adjuvants as cancer vaccines［J］.Blood，2008，11（1）：3116-3125.

［11］Wu JW.Clinical and prognostic significance of regulatory T cell density in peripheral blood of patients with gastric carcinoma［J］.Journal of Clinical Surgery，2014，22（7）：517-519.

［12］Qiu YJ，Hou JP，Li FY，et al.Variation and clinical significance of CD4+CD25+regulatory T cell in pre/postoperation peripheral blood of gastric cancer［J］.Journal of Tianjin Me-dical University，2011，17（3）：388-391.

（收稿：2016-09-13修回：2016-11-24）

Effect ofYangzheng Xiaoji Capsule on Regulatory T Cells(Treg)of MFC Tumor bearing 615Mice

ZHOU Qunqin1,ZHANG Aiqin2,CHEN Shasha3,QIAN Xiang2
1 Keqiao Hospital of TCM,Shaoxing(312030),China;2 Zhejiang Cancer Hospital,Hangzhou(310022),China;3 Taizhou Cancer Hospital,Wenling(317500),China

ObjectiveTo investigate the anti-tumor effects ofYangzheng Xiaoji Capsule and theunderlying immune regulation mechanism.MethodsForty of MFC tumor bearing 615 mice models were established by inoculated subcutaneously way,then were randomly divided into 4 groups（n=10 in each group）:model group,Yangzheng Xiaoji Capsule group,5FU group,and comprehensive treatment group.Another 10 mice served as control group.The growth of tumor in mice and the change of mouse weight were observed.After last dosing,the mice were sacrificed to obtain and weigh the tumor,thymus and spleen,then the tumor volume and the inhibitory rate were calculated.CD4+CD25+ Foxp3+Treg cells proportion in mouse peripheral blood was detected with Flow cytometry.ResultsThe tumor weight in model group,comprehensive group,Yangzheng Xiaoji Capsule group,and 5FU group were 4.46±0.89g,2,21± 0.27g,3,50±0.42g,and 3.30±0.41g,respectively.Compared to model group,the inhibitory rateof comprehensive treatment group,Yangzheng Xiaoji Capsule group,and 5FU group were 50.92%,22.29%,and 25.89%,respectively, with significant difference（P<0.05）.The expression of CD4+CD25+Foxp3+Tregcellsin comprehensive treatment group and Yangzheng Xiaoji Capsule group waslower than that of model group（4.73%±0.35%,5.43%±0.47%vs 7.26%± 1.12%,P<0.05）.ConclusionYangzheng Xiaoji Capsule can suppress the growth of MFC gastric carcinoma,which may be involved in decreasing the level of CD4+CD25+Foxp3+Treg.

Smice;gastric carcinoma;Yangzheng Xiaoji Capsule;CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells

浙江省中医药科技计划项目（No.2014ZB020）

1浙江省绍兴市柯桥区中医医院肿瘤内科（绍兴312030）；2浙江省肿瘤医院中医科（杭州310022）；3浙江省台州市肿瘤医院中医科（台州317500）

张爱琴，Tel：13777462976；E-mail：zhanghaojianbb@163.com