痛泻要方联合乌梅丸对溃疡性结肠炎大鼠HSP70和TLRs作用机制的研究

黄文武，杨 斌，廖莉萍

（井冈山大学附属医院，江西 吉安 343000）

--临床研究--

痛泻要方联合乌梅丸对溃疡性结肠炎大鼠HSP70和TLRs作用机制的研究

黄文武，杨 斌，廖莉萍

（井冈山大学附属医院，江西 吉安 343000）

目的 研究痛泻要方联合乌梅丸对溃疡性结肠炎大鼠HSP70和TLRs的作用机制。方法 选取60只SD大鼠并利用TNBS（三硝基苯磺酸）灌肠法制作UC大鼠模型。比较各组大鼠的一般状态、肠重系数、结肠损伤程度以及HSP70、TLR2和TLR4基因表达情况。结果 治疗过程中，痛泻要方合乌梅丸低、中、高剂量组以及美沙拉嗪组的结肠炎症状都有不同程度的改善；痛泻要方合乌梅丸低、中、高剂量组以及美沙拉嗪组的肠重系数分别为（1.15±0.02）%、（1.01±0.01）%、（1.10±0.01）%和（1.17±0.01）%都显著高于空白对照组的（0.85±0.01）%（P＜0.05），都明显低于模型对照组的（1.29±0.03）%（P＜0.05）；经痛泻要方合乌梅丸中剂量组相比于其他三组的结肠损伤程度更小；与空白对照组相比，模型对照组的HSP70、TLR2和TLR4基因表达明显升高（P＜0.05）；与模型对照组相比，痛泻要方合乌梅丸中、低剂量组的HSP70、TLR2和TLR4基因表达明显降低（P＜0.05）。结论 痛泻要方联合乌梅丸可能是通过抑制结肠粘膜组织的HSP70和TLRs基因表达来治疗溃疡性结肠炎的，其中，中剂量的痛泻要方合乌梅丸的治疗效果较好。

痛泻要方联合乌梅丸；溃疡性结肠炎；大鼠HSP70和TLRs；作用机制

溃疡性结肠炎是一种病因不明的慢性炎症，病情易反复难以根治、复发率极高，故其病程一般都很长[1-2]。如果其久治不愈不仅给患者的日常生活带了不便，而且很有可能发生癌变，严重影响了患者的生活质量[3-4]。本研究选取60只SD大鼠并采用TNBS灌肠法制作了UC大鼠模型，研究了痛泻要方联合乌梅丸对溃疡性结肠炎大鼠HSP70和TLRs的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物制备及剂量计算

（1）痛泻要方合乌梅丸的制备：组成：乌梅15 g、细辛3 g、干姜5 g、桂枝5 g、附子5 g、蜀椒10 g、黄连10 g、人参15 g、当归10 g、黄柏15 g、防风10 g、白术10 g、陈皮6 g、白芍10 g。方法：加10倍的水煎煮上述药材1 h，过滤，用药渣5倍的水煎煮药渣1 h，过滤，合并滤液，浓缩成生药2 g/mL的药液。

（2）剂量计算：大鼠用量按成人用量的10倍计算，大鼠低、中、高剂量按照5 g/kg、10 g/kg、20 g/kg的药物用蒸馏水配成500 g/L、1 000 g/L、2 000 g/L。

（3）美沙拉嗪肠溶片（葵花药业）：每片0.25 g，用量0.5 g/kg，药物用蒸馏水配成50 g/L，大鼠灌肠给药体积为10 mL/kg。

1.2 溃疡性结肠炎大鼠模型的建立 采用TNBS灌肠法制作UC大鼠模型。取3个月龄的SD大鼠，饲养7天后，禁食24 h（不禁水），称重，然后利用10%的水合氯醛（3.8 mL/kg）进行腹腔麻醉，将一橡胶管由大鼠的肛门轻轻插入至约8～10 cm深，再推入0.2 mL/100 g体质量的TNBS溶液（含2.5%TNBS和50%乙醇），灌注时间约5 s，最后为了尽量减少造模试剂的流出，将造模鼠倒置2 min后再放回笼内。

1.3 大鼠分组和给药方法 将60只SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、痛泻要方合乌梅丸低、中、高剂量组、美沙拉嗪组6组，每组10只。造模后第3天，痛泻要方合乌梅丸低、中、高剂量组以及美沙拉嗪组同时开始按照相应的剂量给药，空白对照组和模型组给予等体积蒸馏水，1次/天，持续10天。

1.4 检测项目及方法

（1）观察各组大鼠在治疗过程中精神、饮食、活动等变化；完成后，处死大鼠，取结肠，洗净粪便，滤纸吸干，称量，计算，肠重系数=结肠重/体质量×100%。

（2）取小段结肠并用10%的甲醛固定，用酒精脱水、石蜡包埋后切片，HE染色。用透射电镜观察各组大鼠的结肠超微结构改变及结肠病理变化，评价其损伤程度。

（3）取炎症改变较明显的结肠，洗净后制成匀浆，离心15 min，取上清液分装，-20℃保存，按照鼠HSP70、TLR2和TLR4试剂说明书来检测大鼠结肠组织HSP70、TLR2和TLR4的基因表达。

1.5 统计学方法 运用统计学软件对数据进行处理，计量资料的比较用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠的一般状态及肠重系数比较 在模型建立后，所有大鼠出现了不同程度的发热、精神不振、食欲锐减、懒动、脓血便或粘液便等现象；而空白对照组的体温、精神状态、食欲、运动以及大小便等都正常。治疗过程中，痛泻要方合乌梅丸低、中、高剂量组以及美沙拉嗪组的上述症状都有不同程度的改善；而模型对照组的上述症状更加严重。痛泻要方合乌梅丸低、中、高剂量组以及美沙拉嗪组的肠重系数分别为（1.15±0.02）%、（1.01±0.01）%、（1.10±0.01）%和（1.17±0.01）%都显著高于空白对照组（0.85±0.01）%（P＜0.05），都明显低于模型对照组（1.29±0.03）%（P＜0.05）。2.2各组大鼠的结肠损伤程度比较 空白对照组的结肠表面及肠管内壁均光滑、没有充血水肿现象、没有与周围组织粘连，易于分开，无损伤。模型对照组的结肠管和管壁都有增粗，结肠有充血水肿症状，与胰腺以及周围畅组织等粘连较严重，产生了大面积的黑色坏死面和黏膜肿胀充血的溃疡面，并且黏膜皱襞减少。经痛泻要方合乌梅丸低、中、高剂量以及美沙拉嗪治疗后，模型对照组的结肠症状有所缓解，其中，经痛泻要方合乌梅丸中剂量组相比于其他三组的结肠损伤程度更小。

2.3 各组大鼠结肠组织HSP70、TLR2和TLR4的基因表达比较 与空白对照组相比，模型对照组的HSP70、TLR2和TLR4基因表达明显升高（P＜0.05）；与模型对照组相比，痛泻要方合乌梅丸中、低剂量组的HSP70、TLR2和TLR4基因表达明显降低（P＜0.05）；痛泻要方合乌梅丸高剂量组和美沙拉嗪组的HSP70、TLR2和TLR4基因表达也有一定程度的降低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠结肠组织HSP70、TLR2和TLR4的基因表达比较（x±s，n=10）

3 讨论

溃疡性结肠炎的病因不明，是一种慢性炎症型病，病情易反复、极难根治、复发率超高，故其病程一般都很长[5]。久治不愈的溃疡性结肠炎不仅给患者的日常生活带了不便，而且很有可能发生癌变，徒增了家庭负担[6-7]。乌梅丸在中医治疗溃疡性结肠炎上的研究由来已久[8]，本文结合中医疗法，研究痛泻要方联合乌梅丸对溃疡性结肠炎大鼠HSP70和TLRs的作用机制。

本文研究表明，治疗过程中，痛泻要方合乌梅丸低、中、高剂量组以及美沙拉嗪组大鼠的结肠炎症状都有不同程度的改善；痛泻要方合乌梅丸低、中、高剂量组以及美沙拉嗪组大鼠的肠重系数分别为（1.15±0.02）%、（1.01±0.01）%、（1.10±0.01）%和（1.17±0.01）%都显著高于空白对照组的（0.85±0.01）%，并且都明显低于模型对照组的（1.29± 0.03）%（P＜0.05）；经痛泻要方合乌梅丸中剂量组相比于其他三组的结肠损伤程度更小（P＜0.05）；与空白对照组相比，模型对照组的HSP70、TLR2和TLR4基因表达明显升高（P＜0.05）；与模型对照组相比，痛泻要方合乌梅丸中、低剂量组的HSP70、TLR2和TLR4基因表达明显降低（P＜0.05）。

综上所述，痛泻要方联合乌梅丸可能是通过抑制结肠粘膜组织的HSP70和TLRs基因表达来治疗溃疡性结肠炎的，其中，中剂量的痛泻要方合乌梅丸的治疗效果较好。

[1]张倩倩,杜斌.炎症性肠病的免疫学机制及中药对其免疫学影响的综述[J].中医药导报,2015,21(24):91-94.

[2]程雪,董晓琳,严琴,等.中药治疗溃疡性结肠炎实验研究进展[J].实用中医药杂志,2014,30(1):69-71.

[3]汪悦，查安生.中医药对溃疡性结肠炎作用机制的干预研究[J].中华中医药学刊,2015,33(2):394-396.

[4]赵青春,沈洪,程海波,等.清肠化湿方对HT-29细胞IL-6/ JAK2/STAT3的影响[J].中国药理学通报,2015,31(6):883-885.

[5]沈洪,刘智群,朱荃,等.清肠化湿方对溃疡性结肠炎NF-κB/ Tolls通路的影响及其机制[J].中国中西医结合杂志,2013,33 (9):1216-1220.

[6]李斌,蒋宁,谷松.乌梅丸及其拆方对溃疡性结肠炎大鼠IL-6/ JAK/STAT3信号通路及结肠粘膜病理变化的影响[J].中药药理与临床,2016,32(1):14-17.

[7]赵青春,沈洪,程海波,等.清肠化湿方对实验性结肠炎小鼠IL-6反式信号转导的影响[J].世界科学技术:中医药现代化, 2015,17(6):1249-1253.

[8]周婷婷,仝巧云,袁晋华.溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜SOCS2、SOCS3的表达及意义[J].华中科技大学学报（医学版）,2015, 44(3):285-288.

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.04.007

江西省科技计划项目（20142BBG70119）