九江苦荞大小孢子发生与雌雄配子体发育观察

吴凯，左振君，夏胜应，刘志雄

(长江大学园艺园林学院，湖北 荆州 434025)

九江苦荞大小孢子发生与雌雄配子体发育观察

吴凯，左振君，夏胜应，刘志雄

(长江大学园艺园林学院，湖北 荆州 434025)

采用石蜡切片技术对苦荞(Fagopyrumtataricum)大、小孢子发生及雌、雄配子体的发育进行了观察研究。结果显示：苦荞花药4室，花粉囊壁由表皮、药室内壁、1层中层和1层绒毡层组成；小孢子四分体胞质分裂为同时型，四分体为四面体型，成熟花粉为2细胞型；胚珠直立、双珠被、厚珠心、大孢子四分体直线型、合点端为功能大孢子、蓼型胚囊；大孢子发生和雌配子体发育前期慢、后期快，小孢子四分体时期才能见大孢子母细胞，功能大孢子形成于2细胞花粉形成期，但也随着花粉壁加厚和发育成熟，功能大孢子很快分裂发育成成熟胚囊。

苦荞(Fagopyrumtataricum)；孢子；配子体

苦荞(Fagopyrumtataricum(L.) Gaerth)属蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum)，是药食同源的一年生小杂粮作物，其种子富含类黄酮、芦丁和抗氧化活性物质等，具很高的营养价值和保健功效[1,2]。研究表明，荞麦作为目前唯一种子具高芦丁含量的谷物，其芦丁具有降低血清中髓过氧化物酶和胆固醇水平，及减轻头痛和消除疲劳等优点，成为理想的具食疗潜能的功能食品原料之一，被开发成茶、面条和其他多种保健食品[1,2]；苦荞作为荞麦主要的2个栽培种之一，其种子芦丁含量约为普通荞麦(FagopyrumesculentumMoench)的100倍，营养价值更高[1]。 随着世界经济的发展和人们对健康的重视，苦荞及其相关制品的需求正逐年增加。苦荞原产于我国，在日本、韩国、尼泊尔、美国、俄罗斯和欧洲部分国家也有栽培，因其具有生育期短、耐旱、耐瘠薄等优点，是中国干旱和半干旱地区主要粮食作物之一[3,4]。同时，苦荞花期长、种子熟期同步化程度低，同一植株甚至同一花序上存在不同发育时期的种子，不利机械化作业，加上落粒性、产量低和因自花授粉造成的品种遗传背景单一等特点，使得大面积推广应用困难。

大宗作物的育种实践证明，开展杂交育种是提高自花授粉作物产量、品质和增加遗传多样性的有效途径[5]。由于苦荞杂交育种工作滞后，目前育种方法主要以系统选育和诱变育种为主，产量提高有限，严重地制约着苦荞的开发利用[6]。我国苦荞种质资源丰富，很多资源的综合农艺性状好[7]。这些优异的材料为苦荞杂交育种的开展积累了珍贵的资源。而弄清作物自身花器官的形态特征和发育规律是开展杂交育种的前提和基础。本研究以国家苦荞品种审定标准对照种‘九江苦荞’为试验材料，通过石蜡切片技术，系统研究苦荞花发育过程中大小孢子的发生与雌雄配子体的发育过程，以为苦荞雄性不育系的创制和杂交育种研究积累资料。

1 材料与方法

1.1 材料

‘九江苦荞’由长江大学作物遗传育种研究所麦类作物研究课题组纯化后提供，于2016年3月播种于长江大学作物遗传育种研究所试验田，出苗后常规水肥管理，花分生组织分化后连续取样观察。

1.2 方法

取‘九江苦荞’不同发育时期的新鲜花序和小花芽，立即用FAA固定液(甲醛︰冰乙酸︰70%乙醇=1︰1︰18；v/v)固定24h，经浓度分别为70%、85%、95%和100% 乙醇梯度脱水，每级1h；再依次经50%二甲苯乙醇和100%的二甲苯透明，各2h；38℃下在饱和的二甲苯石蜡溶液中浸蜡12h，后在60℃下用液体纯蜡置换二甲苯石蜡溶液，浸蜡12h，每4h换1次纯蜡，用石蜡包埋。石蜡切片的方法参照文献[8]，略有改动，用Leica RM2235石蜡切片机连续切片，切片厚度8μm,用1%番红-0.1%固绿对染,中性树胶封片后在OLYMPUS BX63显微镜下观察细胞结构并拍照。

2 结果与分析

苦荞为总状花序(图1A)：小花被片5枚，淡绿色、花萼状；雄蕊8枚、外轮5枚、内轮3枚，2轮雄蕊间邻近花丝基部的位置着生8个没有完全退化的圆球形腺体；子房上位，花柱3，3合生心皮1室，内含1直立胚珠(图1B)。

图1 苦荞的花序和花

A.孢原细胞平周分裂成初生辟细胞和造孢细胞(400×)； B.小孢子母细胞和绒毡层形成(400×)；C.绒毡层开始解体，小孢子母细胞开始减数分裂(400×)；D.小孢子形成四面体型四分体，大孢子母细胞形成(400×)；E.小孢子四分体开始解体(400×)；F.三角形单核花粉粒，大孢子母细胞减数分裂(400×)；G.单核花粉变大变圆，直线型大孢子四分体形成(400×)；H.花粉单核靠边期，珠孔端的3个大孢子退化，合点端的发育成功能大孢子(400×)；I.二细胞花粉，功能大孢子形成(400×)；J.成熟花粉粒，功能大孢子第一次有丝分裂；K.卵细胞,成熟花粉粒(400×)；L.双受精后的卵细胞和极核(400×)图2 苦荞大小孢子发生与雌雄配子体发育

2.1 小孢子发生与雄配子体发育

花药4个角隅处的孢原细胞经1次平周分裂，形成内、外2层细胞，外层的为周缘细胞，内层的为造孢细胞(图2A)。周缘细胞继续平周分裂成药室内壁、中层和绒毡层；此时可明显见花粉囊壁由1层表皮、1层药室内壁、1层中层和1层绒毡层构成；造孢细胞则分裂形成小孢子母细胞，小孢子母细胞体积大、核大、核仁明显、质浓，生理活性旺盛(图2B)。苦荞中层和绒毡层细胞解体发生的时间相对较早，随着小孢子细胞母进一步发育进入减数分裂期、中层和绒毡层细胞开始解体为小孢子发育提供营养、整个药室内细胞间隙变得明显，小孢子母细胞处于游离状态(图2C)。随后游离小孢子母细胞连续进行2次的减数分裂，形成四面体型的四分体；在四分体形成过程中，胞质分裂为同时型，但同一朵花不同雄蕊花药药室间小孢子发育具有不同步现象(图2D)。四分体最初包裹在明胶状的胼胝质中，随着胼胝质溶解，小孢子逐渐从四分体中释放出来，开始释放出来的小孢子呈三角型(图2D～F)；随着小孢子的不断发育，小孢子细胞逐渐变大变圆，出现了大的液泡、小孢子核被挤向一边形成单核靠边期小孢子；紧接着，小孢子核分裂成一个大的营养核和一个小的生殖核，形成2-细胞型花粉；此时仍可观察到中层和绒毡层解体的残存结构(图2G～I)。随着2-细胞型花粉的发育变大变圆、花粉壁不断加厚、花粉发育成熟，此时中层和绒毡层才完全消失(图2J～K)。

2.2 大孢子发生与雌配子体发育

苦荞大孢子发生晚于小孢子，当小孢子母细胞减数分裂形成四分体时，才可见大孢子造孢细胞发育成大孢子母细胞(图2D)。大孢子母细胞细胞核大，细胞质浓厚，生理活动旺盛，体积较大，包被在2层珠心细胞中，并与周围珠心组织细胞差异显著(图2 D)。随着内、外轮珠被的出现和发育，可以看到大孢子母细胞经过2次减数分裂形成直线型的四分体(图2F～G)。随着内、外轮珠被继续向前延伸和发育，靠近珠孔端的3个大孢子逐渐退化消失，留下合点端的1个继续发育长大成功能大孢子(图2H～I)。随后，功能大孢子经过连续2次的有丝分裂形成8核7细胞型成熟胚囊(图2J～K)。但很快通过自花授粉和双受精形成2倍体的合子和3倍体的受精极核(图2L)。

3 讨论与结论

苦荞为蓼科荞麦属自花授粉的小杂粮作物，其为总状花序。本研究观察到苦荞子房3心皮合生1室、基底胎座、单个直立胚珠，双珠被、厚珠心，大孢子四分体直线型排裂，合点端为功能大孢子，典型的蓼型胚囊；小孢子母细胞减数分裂中胞质分裂为同时型，小孢子四分体为四面体型，成熟花粉为二细胞型。前人研究表明，花药具4个小孢子囊、花粉二细胞型；二层珠被、厚珠心、倒生胚珠、功能大孢子位于合点端、蓼型胚囊、珠被不具绒毡层为原始性状[9]。苦荞具有较多的原始性状、而胚珠直立则是相对进化的特征。而目前报道的石竹目(Caryophyllales)其他科属植物的胚胎学特征则表现得相对原始,支持了蓼科植物具基底胎座、单个直立胚珠的性状是该目中的衍生类群[10～12]。如核心石竹目藜科(Chenopodiaceae)植物华北驼绒藜[Ceratoidesarborescens(Losinsk.)Tsien.etC.G.Ma]的则具有典型相对原始的胚胎学特征[12]；而该科另一植物甜菜(Betavulgaris)的具备较多的原始胚胎学特征的同时，出现了弯生胚珠的衍生性状[14,15]。在非核心石竹目植物柽柳(Tamarixchinensis)中，其胚胎学重要性状为基底胎座、多数胚珠、倒生，但其胚囊发育为贝母型，4个大孢子全部参与胚囊形成[16]。进一步说明石竹目植物胚胎发育的复杂性。

从大小孢子的发育进度来看，小孢子母细胞形成较早，当小孢子母细胞减数分裂形成四面体型四分体时，珠心中造孢细胞才发育成大孢子母细胞。在小孢子发生与雄配子体发育过程中，绒毡层细胞破坏较早，但完体解体消失持续的时间相对较长，当小孢子母细胞刚进入减数分裂时就可看见绒毡层细胞明显破坏，细胞间间隙明显，中层细胞受到挤压明显遭受破坏，随着四分体解体和雄配子体发育，绒毡层细胞和中层细胞中营养物质被逐渐吸收，至花粉发育成熟时，中层和绒毡层细胞才完全消失。在大孢子发生与雌配子体发育过程中，大孢子前期发育相对较慢，雌配子体发育相对进度较快；小孢子四分体时期时，大孢子母细胞特征明显，但直到2细胞形花粉形成时，功能大孢子才形成，随着花粉壁的加厚和发育成熟，功能大孢子很快发育成成熟胚囊，为自花受精作准备。

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[编辑] 余文斌

2017-02-20

湖北省教育厅重点项目(D20151302)。

吴凯(1991-)，男，硕士生，研究方向为园艺植物遗传发育与种质创新。通信作者：刘志雄，zxliu77@yahoo.com。

Q949.744;Q945.5

A

1673-1409(2017)10-0034-04

[引著格式]吴凯，左振君，夏胜应，等.九江苦荞大小孢子发生与雌雄配子体发育观察[J].长江大学学报(自科版)，2017，14(10)：34～37,78.