小滴法精子冷冻在流程化治疗无精子症中的应用体会

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2017.09.086

[摘要] 目的 探討小滴法精子冷冻在流程化治疗无精子症的临床效果及相关治疗措施。 方法 方便选取该院2009年1月—2014年12月接受小滴法精子冷冻技术不育男性180例开展回顾性分析，按WH05人类精液检查与处理实验手册要术进行精液检查后，梗阻性无精子症患者120例，非梗阻性无精子症患者60例；另选取40例取精困难不育男性正常精液按此方法冷冻（对照组），统计、分析精液常规正常的40例取精困难不育患者、120例梗阻性无精子症患者、60例非梗阻性无精子症患者精子复苏率、妊娠率。 结果 对照组中40例取精困难不育患者中解冻40例，精子的复苏率均大于60%，其中18例获得女方妊娠（18/40）妊娠率45%；梗阻性无精子症120例中解冻30例，获得女方妊娠 12例（12/30）妊娠率40%；非梗阻性无精子症60例解冻25例获得女方妊娠10例（10/25）妊娠率40%。 结论 小滴法精子冷冻在流程化治疗无精子症中的应用效果较好，同时由于每次冻存的最小冷冻液体剂量仅为20μL，载体为目前成熟的商品化载体，技术操作简单、价格相对低廉，具有临床推广应用价值。

[关键词] 小滴法精子冷冻；流程化治疗；无精子症

[中图分类号] R69 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）03（c）-0086-03

Application Experience of Droplet Sperm Cryopreservation in the Processed Treatment of Azoospermia

HU Hao-rui

Assisted Reproductive Department， Guiyang Maternity and Child Health Care Hospital， Guiyang， Guizhou Province， 550002 China

[Abstract] Objective To discuss the clinical effect of droplet sperm cryopreservation in the processed treatment of azoospermia and related treatment experience. Methods 180 cases of infertile males receiving the droplet sperm cryopreservation from January 2009 to December 2014 were convenient selection retrospectively analyzed and WH05 human semen examination showed that there were 120 cases of patients with obstructive azoospermia and 60 cases of patients with non-obstructive azoospermia， and the normal semen of 40 cases of infertile males with semen procurement difficulty were selected as the control group， and the recovery rate and pregnant rate of the three groups were counted and analyzed. Results In the control group， the sperm of 40 cases unfreezed， and the recovery rate of sperms was more than 60%， and 18 cases obtained pregnancy （18/40） and pregnancy rate was 45%， in the 120 cases with obstructive azoospermia， the sperms of 30 cases unfreezed， and 12 cases obtained pregnancy，（12/30） and the pregnancy rate was 40%， and in the 60 cases of patients with non- obstructive azoospermia， the sperms of 25 cases unfreezed， and 10 cases obtained pregnancy and the pregnant rate was 40% （10/25）. Conclusion The application effect of droplet sperm cryopreservation in the processed treatment of azoospermia is better， at the same time， the minimum freezing liquid dosage is only 20μL and the carrier is the mature commercialization carrier， and the technical operation is simple and the price is relatively low， which is worth clinical promotion and application.

[Key words] Droplet sperm cryopreservation； Processed treatment； Azoospermia

据调查，工业化国家中生育年龄夫妇中，罹换不育症的人群比例达到10%～15%[1]。其中，单独的男、女性因素各为35%，其余30%属于是共同因素[2]。在不育男性中，无精子症占比达到5%～20%；在普通人群中，无精子症占比则为2%[3]。无精子症中，非梗阻性无精子症占71%，其中34%为唯支持细胞综合征，9%为克氏综合征，9%为精子成熟阻滞，5%为Y染色体微缺失，4%为隐睾症，4%为外伤，4%为外源性雄激素补充，4%为遗传因素等；梗阻性无精子症占29%[4]。基于以上不同的无精子症病因，有不同的处理方式。但规范化的治疗，以给男性一个机会，尤其是非梗阻性无精子症患者的精子保存技术进展，将对这部分人群的生育力保存给出一个好的解决答案。在目前由作者提出的流程化治疗方案[5]中，作为玻璃化冷冻的小滴法精子冷冻技术目前是该院的主要冷冻方式之一。为了探讨小滴法精子冷冻在流程化治疗无精子症的临床效果，该研究方便选取了该院2009年1月—2014年12月接受小滴法精子冷冻技术的无精子症患者180例为研究对象，将其与另外接受小滴法精子冷冻技术的40例取精困难不育男性的精子复苏率、妊娠率进行对比分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析该院接受小滴法精子冷冻技术不育男性180例，平均年龄（34.10±5.14）岁，疗程平均（6.1±3.2）年。所有患者均按WHO人类精液检查与处理实验手册要术进行精液检查后，诊断为梗阻性无精子症和非梗阻性无精子症。其中梗阻性无精子症120例，非梗阻性无精子症60例，排除因勃起功能障碍、不射精、逆行射精症的不育男性。另有40例取精困难不育男性正常精液按此方法冷冻。

1.2 诊疗流程

不育男性诊疗流程[5]如下（图1）：①按照WHO人类精液处理和检验实验手册第5版，连续3次精液处理后未见精子；②若是诊断为梗阻性无精子症，则予以手术治疗或是人类辅助生殖技术；③若是诊断为特发性无精子症，则予以药物治疗（不建议不治疗或是直接采取AID等他精法助孕）。当药物治疗无效的情况下，采取AID等他精法助孕；药物治疗有效，再次进行睾丸活检发现精子或是在精液中发现精子，此时予以精子冻存并拟行人类辅助生殖技术助孕。

1.3 方法

将梗阻性无精子症与非梗阻性无精子症患者（治疗后获得极少量精子的）的附睾液或睾丸组织提取物予250 g离心力离心取沉淀备用。将取精困难不育男性精液以percoll液40%上层液面、80%下层液面250 g离心力20 min密度梯度离心并精子洗涤剂洗涤后备用。将两组精子分别与该院自配精子玻璃化冷冻试剂按1：1混匀静置5 min后置于冷冻盒上方液氮液平面上20 cm处约1 min，按20 μL/滴滴入液氮。精子冰滴坠入冷冻盒中大皿内收集后无菌镊镊取移入冷冻管中保存。所有操作中物品及液氮均为一人一器，冷冻管半浸入液氮后冰滴存入后封口干式保存以减少可能得保存罐中液氮流入的污染。同时也为取出解冻时鉴别是否有氮液流入冷冻管中的风险判断。

1.4 观察指标

统计、分析精液常规正常的40例取精困难不育患者、120例梗阻性无精子症患者、60例非梗阻性无精子症患者精子复苏率、妊娠率。

2 结果

冷冻结果，作为对照的精液常规正常的40例取精困难不育患者中解冻40例，精子的复苏率均大于60%，其中18例获得女方妊娠（18/40）妊娠率45%。梗阻性无精子症120例中解冻30例获得女方妊娠 12例（12/30）妊娠率40%。非梗阻性无精子症60例解冻25例获得女方妊娠10例（10/25）妊娠率40%。

3 讨论

无精子症的病因复杂，其治疗一直是泌尿男科学领域难题之一，临床上尚无确切疗法，临床诊疗也存在诸多不规范的问题，如：检查项目选择不当，以致于出现过度诊断治疗的情况，这不仅会对患者身心造成伤害，更会给患者及其家庭带来较大的经济负担，基于此，规范诊疗流程具有必要性[5]。

根据是否存在梗阻因素，可将无精子症分为两大类，一是梗阻性无精子症；二是非梗阻性无精子症。男性生育力保存，尤其是非梗阻性无精子症患者男性生育力的保存是目前临床治疗中的一个非常重要的问题。在以往，非梗阻性无精子症患者被认为是无法治愈的，一般建议领养或是供精。自90年代以来，辅助生殖医学的不断发展，为非梗阻性无精子症患者治疗提供了技术支持，通过外科取精技术即可由患者睾丸内获得精子，其后卵泡浆内单精子注射技术实现女方妊娠。但是，从患者睾丸内取精存在一定的失败率，而反复睾丸外科活检取精会对睾丸功能产生不利影响，根据Verheyen G等人[6]研究发现，第一次睾丸活检发现精子的患者中，30%在第二次活检时无法找到精子。基于此，对第一次活检找到的睾丸精子予以冷冻保存十分必要。同时，对于非梗阻性无精子症患者而言，稀少精子冻存也有利于减少其不必要的供精人工受精和供精体外受精-胚胎移植技术的实施。同时，卵胞浆内单精子显微注射技术（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI）的应用，实现了临床妊娠率、胚胎种植率的有效提升。2004年靳镭等[7]用冻融PESA精子（经皮附睪精子抽吸术）进行ICSI获得成功妊娠。

该研究中，选取了该院2009年1月—2014年12月接受小滴法精子冷冻技术不育男性180例开展回顾性分析，根据研究结果显示梗阻性无精子症120例中解冻30例获得女方妊娠 12例（12/30）妊娠率40%。非梗阻性无精子症60例解冻25例获得女方妊娠10例（10/25）妊娠率40%，与前人研究相符，冻融精子予以ICSI是可行的。

由此提示，小滴法精子冷冻技术临床应用效果较好，一方面玻璃化冷冻无需使用冷冻保护剂，通过极高的冻融速率令精子细胞内外液之间几乎同步实现液态与玻璃态的转换，精子细胞内外不会产生冰晶，有效避免了机械性损伤、理化损伤的出现[8]；同时玻璃化精子冷冻时，每次冻存的最小冷冻液体剂量仅为20 μL，载体均为目前成熟的商品化载体，技术操作简单。

4 结论

玻璃化精子冷冻液为作者自配，价格远较商品化试剂低廉。对于在西部欠发达地区的人类辅助生殖技术机构开展存在较适宜的条件，对于减轻西部经济收入较低家庭的负担有益，值得临床推广应用。

[参考文献]

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[5] 胡皓睿.200例無精子症流程化诊疗体会[J].深圳中西医结合杂志，2015（4）： 85-86.

[6] Verheyen G， De C I， Tournaye H， et al. Comparison of four mechanical methods to retrieve spermatozoa from testicular tissue[J]. Human Reproduction， 1995， 10（11）：2956-2959.

[7] 靳镭，王俊霞，朱桂金，等.冻融经皮抽吸附睾精子卵细胞胞质内单精子注射1例分娩报告[J].中华男科学杂志，2004， 10（3）：227-228.

[8] 葛斌，杨智敏，刁英，等.无保护剂玻璃化冷冻技术在冻存PESA精子中的实用性研究[J].实用医学杂志，2016，32（1）：91-93.

（收稿日期：2016-12-25）