魔芋甘露寡糖对植物乳杆菌和粪肠球菌共培养时发酵行为的影响

郭 媛，王洪善，周 康

(1.无锡市科学技术情报研究所，江苏 无锡 214001：2.江南大学 药学院，江苏 无锡 214122)

魔芋甘露寡糖对植物乳杆菌和粪肠球菌共培养时发酵行为的影响

郭 媛1，王洪善2，周 康2

(1.无锡市科学技术情报研究所，江苏 无锡 214001：2.江南大学 药学院，江苏 无锡 214122)

魔芋甘露寡糖是一种新型的功能低聚糖，具有益生元功能，然而它们对肠道微生物的选择性尚不明确。本文选取具有代表性的肠道微生物植物乳酸菌及粪肠球菌，进行体外纯培养及共培养发酵实验，观察不同碳源条件下微生物的生长及代谢情况以及微生物之间的交互作用，探究寡糖对肠道微生物的作用机理。结果发现，在以葡萄糖、果寡糖、甘露寡糖为碳源的肠道模拟培养基中，植物乳杆菌、粪肠球菌都能较好地生长并产生一定的有机酸；共培养中，植物乳杆菌的生长相对粪肠球菌占据更大的优势，但共培养的代谢物组分存在显著差异；甘露寡糖显示出对上述几株肠道益生菌具有更为明显的促生长作用。

魔芋甘露寡糖；益生菌；益生元；微生物交互作用

功能性寡糖是被动物摄入后不被口腔、胃、小肠消化吸收，但能在肠道后端发挥作用的一类寡糖。目前，已知的有1 000多种功能性寡糖，应用比较广泛的主要有甘露寡糖、果寡糖、大豆寡糖、半乳寡糖以及木寡糖等[1-2]。大量体外培养和动物实验研究证实功能性寡糖能促进肠道有益菌，尤其是乳杆菌的增殖。由于人体食用功能性寡糖后，本身不能对其消化分解，而乳杆菌等有益菌含有分解这些低聚糖的酶进而利用这些糖类进行发酵，结果产生的短链脂肪酸(SCFA)能使肠道pH降低，从而抑制对酸敏感的沙门氏菌等有害菌的生长[3]。此外，益生菌等对病原菌生物具有屏障作用，通过其磷壁酸与肠粘膜上皮细胞结合，占据肠粘膜表面形成生物学屏障，阻止致病菌，调节致病菌的入侵和定植[4]。

甘露寡糖(Mannan-oligosaccharide，MOS)是由2～10个甘露糖与葡萄糖或者半乳糖残基通过α-1，6、α-1，3、α-1，2、β-1，4或β-1，3糖苷键链接而成的低聚糖[5]。甘露寡糖大量来源于葡甘聚糖或半乳甘露聚糖，这些聚糖广泛存在野生植物资源中，是甘露聚糖类植物资源精加工的重要方向。魔芋甘露寡糖(Konjakmannan-oligosaccharide)是通过化学或生物方法将魔芋葡甘聚糖降解得到的一种低分子糖。魔芋葡甘聚糖是β-葡萄糖与β-甘露糖通过β-1，4糖苷键链接而成的多糖[6]。目前酶解法是大量获得MOS的最有效手段[7]。众多研究表明，MOS具有多种生理活性，主要是调节肠道菌群微生态、改善肠道微环境进而促进宿主的健康、增强免疫活性、改善血糖血脂水平等[8-10]，越来越多地受到人们的关注与认同。然而目前MOS对肠道微生物的具体影响，以及产生的微生物之间的相互作用类型以及机制尚不完全明确。因此亟待解析这方面的信息以理解MOS的益生机制。同时，MOS对于肠道菌群是选择性的碳源，由此得到的发酵代谢物又可以对肠道微生物群落造成影响。因此，以MOS为外界刺激因素，探索及阐明益生元对典型肠道微生物发酵行为的影响可为该产品的进一步开发提供依据。

本文选取具有代表性的肠道微生物植物乳酸菌及粪肠球菌，进行体外纯培养及共培养发酵实验，观察不同碳源条件下微生物的生长及代谢情况以及微生物之间的交互作用，探究寡糖对肠道微生物的作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验材料

种子培养基：MRS培养基(g/L)：蛋白胨 10，牛肉膏 10，酵母粉 5，葡萄糖 20，乙酸钠 5，柠檬酸氢二胺 2，磷酸氢二钾 2，七水合硫酸镁 0.58，一水合硫酸锰 0.19，吐温80 1。pH至6.2，灭菌时温度为121 ℃，时长为20 min。

模拟肠道培养基(g/L)：葡萄糖(魔芋甘露寡糖或果聚糖)8，胰蛋白胨 3，酵母粉 4.5，胆盐3号 0.4，L-半胱氨酸盐酸盐 0.8，氯化钠4.5，氯化血红素 0.05，六水氯化镁 0.45，六水氯化钙 0.2，磷酸氢二钾 0.4，吐温80 1。所有试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。本研究涉及的植物乳杆菌和粪肠球菌均为实验室保藏菌种；魔芋甘露寡糖来自成都永安缘河有限公司，果聚糖购自美国Amresco公司。

1.2 培养条件

植物乳杆菌37 ℃活化18 h，粪肠球菌37 ℃活化24 h后分别进行植物乳杆菌纯培养及植物乳杆菌+粪肠球菌共培养发酵实验。纯培养及共培养菌种接种量均为1%，发酵体系50 mL，置于37 ℃厌氧培养箱静置培养发酵48 h。每12 h取样。

1.3 pH以及OD检测

发酵过程中发酵液的pH和OD值分别采用pH计和Molecular Devices测定，每个时间点取3次测量的平均值。

1.4 TLC分析

TLC步骤如下：取硅胶薄板一块，在距底边1.0 cm处划一条直线，在直线上每隔1.5～2.0 cm作一记号，分别吸取梯度乙醇沉淀得到的MOS上清液及沉淀复溶液点样，控制点样斑点直径不超过2 mm。将薄板点样一端放入盛有展开溶剂已进行预饱和的层析缸中，展开剂液面不得超过点样线，层析缸密闭，待展开完全后取出薄板吹干，将显色剂均匀喷雾在薄板上，85 ℃显色10 min，拍照保存。展开剂按照V(正丁醇)∶V(乙酸)∶V(水)=2∶2∶1的比例配置展开剂400 mL。

苯胺-二苯胺磷酸显色剂的配制：准确称取二苯胺4 g，与4 mL苯胺与20 mL 85%磷酸共溶于200 mL丙酮中，避光保存于棕色瓶中备用。

1.5 培养物有机酸分析

将培养液离心(12 000 r/min，5 min)获得上清液。准确量取 2 mL 发酵上清液，分别加入 800 μL硫酸锌(300 g/L)和 800 μL亚铁氰化钾(106 g/L)，振荡混匀，离心，取上清液用 0.22 μm 微孔滤膜过滤后过 Sep-Pak C18预处理小柱除色素，为待测样品。取 1 mL 各单标及混标样品过 0.22 μm 微孔滤膜，为待测标样。处理后的各样品使用HPLC进行有机酸分析。色谱柱：Waters Atlantis T3，4.6 mm×250 mm，5 μm；流动相：20 mmol/L磷酸二氢钠，用磷酸调 pH2.7；进样体积：10 μL；流速：0.7 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：UV210 nm。分别在进样之前及测定之后用纯甲醇及5%甲醇平衡色谱柱。标样峰面积/样品峰面积=标样有机酸含量/样品有机酸含量，对样品中各有机酸进行绝对定量。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的发酵

首先通过肠道模拟培养基以及厌氧条件的培养，考察葡萄糖、果寡糖以及甘露寡糖为碳源的情况下，植物乳杆菌、粪肠球菌以及他们的共培养物的生长及培养物pH变化情况。结果如图1、图2所示。

图1 不同寡糖为碳源的情况下，植物乳杆菌、粪肠球菌纯培养及共培养过程中pH变化情况

图2 不同寡糖为碳源的情况下，植物乳杆菌、粪肠球菌纯培养及共培养过程中OD变化情况

粪肠球菌的生长情况较好，但是pH降低幅度较小。粪肠球菌与植物乳杆菌共培养时，菌体生长以及pH降低的情况都与植物乳杆菌纯培养物较相似。其中以葡萄糖为底物的情况下，粪肠球菌和植物乳杆菌的生长情况最好，但是共培养物的生长情况较每株菌的纯培养物相对较差。由pH降低可知，植物乳杆菌的pH下降程度要大于粪肠球菌。在果寡糖为底物的情况下，肠球菌的pH降低幅度与共培养物相比，差异较大。由OD值升高而后保持不变可推测，两种菌都可以利用上述三种碳源进行生长，随着碳源的消耗，都各自达到了生长的稳定期，但实验所研究的两种菌利用寡糖的能力不同，即不同寡糖对不同菌的生长促进作用不同。其中葡萄糖对三种菌的增殖效果最显著，但肠道环境中几乎没有葡萄糖，因此，本研究中，仅使用葡萄糖碳源作为对照。本研究结果显示，甘露寡糖对粪肠球菌的增殖效果最显著，而植物乳杆菌在考察的几种寡糖中，并没有体现显著的偏好。

2.2 不同发酵时间的发酵上清液中甘露寡糖的TLC分析

由图3可见，小分子量的甘露寡糖在纯培养和共培养的情况下均优先被利用，大分子量的寡糖未有明显利用情况。在TLC结果中，下层分子量较大的糖无明显衰减趋势，上层分子量较小的糖衰减趋势较明显，可推测，两种菌更容易利用寡糖中相对分子量较小的，分子量较大的糖利用率相对较低。

图3 以甘露寡糖为底物，不同发酵时间的

2.3 发酵液中有机酸分析

在检测到的几种有机酸中，发酵结束时酒石酸、丙酮酸和乳酸含量相对于开始时有增加，说明发酵过程会产生酒石酸、丙酮酸及乳酸。除以葡萄糖为碳源，发酵结束时琥珀酸有增加，以甘露寡糖及果聚糖为碳源琥珀酸并没有明显增加。在以甘露寡糖和果聚糖为碳源的情况下，与植物乳杆菌纯培养物相比，植物乳杆菌和粪肠球菌的共培养物的酒石酸、丙酮酸和积累量都有显著提升；同样地，琥珀酸积累量变化不大甚至还略有降低。

表1 不同寡糖为碳源的情况下，植物乳杆菌、粪肠球菌纯培养及共培养物中有机酸分析

3 讨 论

从微生物交互作用角度，通过对植物乳杆菌与粪肠球菌的共培养的实验结果分析认为：在植物乳杆菌与粪肠球菌的共培养中，植物乳杆菌是优势微生物，其与粪肠球菌可能存在竞争关系。具体可能存在的原因如下：1)植物乳杆菌对甘露寡糖等的利用能力更强，体现生长优势；2)植物乳杆菌在发酵过程中，产生抑制其他微生物生长的代谢产物，导致其他微生物生长较弱。通过比较植物乳杆菌和粪肠球菌的纯培养和共培养体系发现，虽然纯培养时，粪肠球菌比植物乳杆菌生长情况好，但是二者共培养时，与植物乳杆菌纯培养生长趋势较一致，粪肠球菌未能体现其生长优势，分析认为，上述两种原因中后者在植物乳杆菌与粪肠球菌共培养时体现较为显著。

由有机酸结果分析，植物乳杆菌与粪肠球菌的共培养相对植物乳杆菌的纯培养而言，酒石酸和琥珀酸的含量降低，而丙酮酸及乳酸的含量升高；另外不同的寡糖对他们的发酵行为也存在影响，例如以葡萄糖为碳源时，植物乳杆菌与粪肠球菌的共培养相对植物乳杆菌的纯培养而言，酒石酸含量升高，而以甘露寡糖为碳源时其含量为下降结果。说明纯培养与共培养之间存在差别，并且植物乳杆菌的代谢产物被其他微生物作为前体物质利用，进一步参与细胞代谢，导致部分代谢产物在共培养时积累量下降。

本研究对2株肠道微生物进行了纯培养和共培养的发酵行为分析，同时比较了碳源对这些微生物之间交互作用的程度的影响。甘露寡糖对益生菌存在一定的增殖作用，另外也发现粪肠球菌与植物乳杆菌共培养时，植物乳杆菌为优势微生物，但有机酸等代谢物的积累情况显著区别于植物乳杆菌纯培养物。这些信息为益生元、益生菌以及合生元的选择及配伍提供了基础信息。

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Effect of Konjacmannan Oligosaccharides on the Co-culture ofLactobacillusplantarumandEnterococcusfaecalis

Guo Yuan1，Wang Hongshan2，Zhou Kang2

(1.Wuxi Institute of Scientific and Technical Information，Wuxi 214001，China; 2.School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Konjacmannan oligosaccharidesare is considered as a new type of prebiotic，with many physiological functions，such as adjusting the structure of intestinal flora，anting inflammatory，improving body immunity，promoting animal growth.Mannan oligosaccharide(MOS)has positive effects on gut microbiota，but its selectivity towards microorganism is still unclear.In this study，we used representative intestinal microbial strains，LactobacillusplantarumandEnterococcusfaecalisto culture with mannan oligosaccharides as carbon resource，and fructooligosaccharide(FOS)and glucose were applied as controls.Invitromonoculture and co-culture fermentation experiments were carried out to monitor the growth and metabolism of microorganisms.The interactions between microorganisms under different carbon sources was also studied.The results showed that bothLactobacillusplantarumandEnterococcusfaecaliscan utilize glucose，FOS and mannan oligosaccharide to grow.Lactobacillusplantarumis the dominant strain in the co-culture withEnterococcus.However，the metabolites varied a lot in the co-culture compared with monoculture ofLactobacillusplantarum.

Konjacmanno oligosaccharides;probiotics;prebiotics;microbial interaction

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.02.004

2016-08-28

郭媛(1980—)，女，工程师，硕士。研究领域：微生物与生化药学。E-mail：guoyuanwx@163.com

Q53

A

1006-9690(2017)02-0013-04