UPLC-MS/MS同时测定皂角中槲皮苷、槲皮素、山柰酚、芦丁的含量

于畅游 田冬梅 娄志红

（黑龙江省食品药品检验检测所，哈尔滨 150088）

UPLC-MS/MS同时测定皂角中槲皮苷、槲皮素、山柰酚、芦丁的含量

于畅游 田冬梅 娄志红*

（黑龙江省食品药品检验检测所，哈尔滨 150088）

建立了超高效液相-质谱联用（UPLC-MS/MS）法同时测定药用植物皂角中槲皮苷、槲皮素、山柰酚和芦丁含量的分析方法。优化的分析条件为：流动相：甲醇-水溶液（42∶58，V/V）；流速：0.25 mL/min；柱温：25℃；进样量：10 μL。采用电喷雾离子源进行电离，多离子反应监测（MRM）模式进行信号采集，采用外标法进行定量，结果表明，在不同检测范围内各目标化合物线性关系良好（R2>0.9997）。同时，应用建立的方法对比分析了4种目标化合物在皂角果荚和皂角刺两个部位的含量水平。

超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)；皂角；槲皮苷；槲皮素；山柰酚；芦丁

皂角（Gleditsia sinensis）为豆科皂荚属落叶乔木，是我国特有的树种之一[1]。皂角的种子和皂角刺等诸多部位均可入药，具有抗菌抗炎、免疫调节与抗过敏、抗肿瘤等作用[2-6]。研究表明，皂角含有的槲皮苷、槲皮素、山柰酚、芦丁是皂角中常见的活性成分[7-8]。为更加快速高效检测分析皂角活性成分的水平，本研究应用超高速液相色谱-质谱联用仪（UPLC-MS/MS）建立了同时测定皂角中槲皮苷、槲皮素、山柰酚、芦丁含量的分析方法，同时应用所建立的方法对比分析了上述4种目标化合物在皂角果荚和皂角刺两个部位的含量水平，为进一步开发利用皂角的药用价值提供了理论和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

皂角刺及皂角果荚于2017年1月采自于黑龙江省哈尔滨市东北林业大学实验林场(45°73′N, 126°56′E)，实验前将皂角刺及果荚分别用粉碎机粉碎，粉末过20目筛备用；槲皮苷、槲皮素、山柰酚、芦丁（纯度均≥98%）标准品购于中国药品生物制品检定所；色谱甲醇、乙腈购于北京百灵威公司；色谱甲酸购于美国Sigma公司；去离子水使用超纯水仪自制。

1.2 仪器与设备

Qtrap 5500质谱仪（美国AB公司）；色谱仪选用日本沃特斯的超高效液相色谱仪，使用LC-20AD泵，温度控制器，柱温箱，SIL-20A自动进样器；FZ-06中药粉碎机（浙江温岭市百乐粉碎设备厂）；250DC型数控超声波清洗器（江苏昆山超声仪器有限公司）；BS124S电子天平（德国Sartorius公司）；Millipore超纯水仪（法国Millipore公司）。

1.3 方法

1.3.1 供试样品溶液的制备

称取皂角刺及果荚粉末各0.5g，加入甲醇20mL超声提取（100 kHz，40℃）30 min，过滤后将残渣再加入20 mL溶剂超声提取30 min，过滤后将两次滤液合并，测定前用0.45 μm的微孔滤膜过滤。

1.3.2 标准品溶液的制备

分别称取适量标准品用色谱甲醇溶解、定容，配制成1 mg/mL的标准品溶液，存于4℃冰箱中备用，使用前根据需要用流动相配制成标准工作液。

1.3.3 UPLC-MS/MS方法

1.3.3.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 Column (1.7 μm,2.1 mm×50 mm)；流动相：甲醇-水溶液（42:58，V/V）；流速：0.25 mL/min；柱温：25℃；进样量：10 μL。

1.3.3.2 质谱条件

采用电喷雾离子源(electrosprayionization，ESI)，正离子扫描模式，多离子反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)扫描方式[9]；锥孔电压是3 kV；离子源雾化温度5000℃；雾化气25psi，气帘气15psi。

1.4 精密度及准确性考察

准确量取含槲皮苷、槲皮素、山柰酚和芦丁的标准品溶液，在同一天内重复进样6次，计算日内精密度及准确性[10]。

1.5 标准曲线的绘制

将4种标准品溶液用流动相稀释成不同浓度的工作液，按上述UPLC-MS/MS方法分别进行检测，将标准品工作液浓度（x）与峰面积（y）进行线性回归，得到回归方程和相关系数（R2），确定线性范围。

1.6 数据统计分析

相同提取条件下，每个样品重复3次，实验结果取平均值，采用SPSS 18.0对其做方差，SigmaPlot 10.0用于绘制数据图像。

2 结果与讨论

2.1 UPLC-MS/MS分析条件的优化

对比电喷雾离子源正、负离子扫描模式下槲皮苷、槲皮素、山柰酚和芦丁标准品的结果表明，目标化合物在正离子扫描模式下电离信号高于负离子扫描模式，因此采用正离子扫描模式对目标化合物进行质谱分析。通过对质谱条件的优化得出最优的质谱条件为：锥孔电压是3 kV；离子源雾化温度5 000℃；雾化气25 psi，气帘气15 psi；4种具有药用活性的化合物碎裂离子、去簇电压、碰撞电压、碰撞室射出电压见表1。对超高效液相的流动相的组成和比例进行考察的结果表明，使用甲醇-水溶液作为流动相的组成时，灵敏度高且分离效果显著，其中甲醇与水的比例为42∶58时，所测物质的出峰时间适中，分离效果好，峰形对称。因此选择甲醇-水溶液（42∶58，V/V）作为分离槲皮苷、槲皮素、山柰酚和芦丁的流动相。

在各项质谱条件及参数优化完成后，应用最优的UPLC-MS/MS方法同时定量检测目标化合物标准品的色谱图（图1），其中芦丁的出峰时间为2.85 min、槲皮苷的出峰时间为4.01 min、槲皮素的出峰时间为5.05 min、山柰酚的出峰时间为5.75 min。

表1 4种目标化合物的质谱分析条件参数(正离子模式)

图1 目标化合物标准品的UPLC-MS/MS色谱

2.2 分析方法的考察

准确量取含槲皮苷、槲皮素、山柰酚和芦丁的标准品溶液连续进样6次，计算精密度及准确性的结果（表2）表明，仪器的精密度及准确性良好。

表2 精密度、准确性实验结果

2.3 标准曲线的绘制

按照上述分析方法的条件，取4种目标化合物的标准品溶液进行UPLC-MS/MS分析，将浓度和峰面积（3次平均值）进行线性回归，并得到回归方程和相关系数。由表3可知，槲皮苷、槲皮素、山柰酚和芦丁分别在10～100 000、100～100 000、10～100 000、100～1 000 000 ng/mL范围内线性关系良好，R2均>0.999 7，充分证明了所建立方法的灵敏度较高。

表3 回归方程、相关系数及线性范围(n=3)

2.4 皂角刺与果荚中目标化合物的含量

取1.3.1项所配制的样品溶液，按照上述的实验方法对皂角刺及皂角果荚进行UPLC-MS/MS分析，记录峰面积，并由2.3中所得的回归方程计算槲皮苷、槲皮素、山柰酚和芦丁的含量。测定结果表明，皂角刺中，槲皮苷、槲皮素、山柰酚和芦丁的含量分别为75.983、4.435、11.336、412.409 μ g/g；皂角果荚中4种目标化合物的含量分别为0.391、18.415、10.014、292.265 μ g/g。槲皮苷和芦丁在皂角刺中的含量高于果荚中的含量，具有显著性差异（p<0.05）；槲皮素在皂角刺中的含量低于果荚中的含量，具有显著性差异（p<0.05）；山奈酚在皂角刺和果荚中的含量相近，无显著差异。

3 结语

本实验建立了UPLC-MS/MS法同时测定皂角槲皮苷、槲皮素、山柰酚、芦丁含量的方法，经过方法学考察证明，此方法可以快速、灵敏地实现皂角中4种目标化合物的同步定量分析。同时，应用建立的方法对比分析了皂角刺及皂角果荚两个部位4种目标化合物的含量水平，为皂角的综合开发利用提供了科学依据。

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［6］徐哲.皂角刺抗肿瘤活性成分与含量测定方法研究［M］.沈阳:沈阳药科大学,2007.

［7］李荣,肖顺汉,刘明华.皂角刺抗肿瘤作用研究新进展［J］.四川生理科学杂志,2009,31(1):29-31.

［8］李万华,傅建熙,范代娣,等.皂角刺化学成分的研究［J］.陕西理工学院学报(社会科学版),1999(3):41-42.

［9］《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编彩色图谱,(第二版)［M］.北京:人民卫生出版社,1996.

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第1作者简介：于畅游（1983-），女，主管药师，研究生，研究方向：食品、药品、医疗器械等微生物检验。

Determination of Quercetin-3-O-rhamnoside、Quercetin、Kaempferol and Rutin of Gleditsia sinensis Harms by UPLC-MS/MS

YUChangyou
（Heilongjiang Institute for Food and Drug Control,Harbin150088）

In this study,we established an UPLC-MS/MS method for the simultaneous determination of quercetin,quercetin,kaempferol and rutin in Gleditsia sinensis.By investigation of chromatography and mass spectrometry methods,the optimum analytical conditions:Mobile phase of methanol-water solution (42∶58,V/V);flow rate,0.25 mL/min;column temperature,25℃;sample size,10 μL.Using electrospray ionization(ESI)ionization,multiple reaction monitoring(MRM)mode for signal acquisition,quantified using the external standard method.The result showed that the test at different concentration range was a great linear relationship(R2>0.9997).Using this method,we assayed and tested the contents of the involved four compounds in thorn and pod,showing high sensitivity,good selectivity and shorter analysis time.

UPLC-MS/MS;Gleditsia sinensis;Quercetin-3-O-rhamnoside;Quercetin;Kaempferol;Rutin

Q946.83+3,TH 843

A

娄志红（1971-），女，主任药师。

2017-01-20

（责任编辑：王岳）

1001-9499（2017）03-0049-03