miR-497对肝癌细胞增殖、凋亡的影响及机制

张猛，张锐，杨季红，谭雨莎，张笑影，贾佳

(河北大学附属医院，河北保定071000)

miR-497对肝癌细胞增殖、凋亡的影响及机制

张猛，张锐，杨季红，谭雨莎，张笑影，贾佳

(河北大学附属医院，河北保定071000)

目的 探讨微小RNA-497(miR-497)对肝癌细胞增殖能力、凋亡的影响及机制。方法 RT-PCR观察肝癌组织和癌旁组织、肝癌细胞和正常肝细胞miR-497的表达差异；转染肝癌细胞过表达miR-497，MTT法和软琼脂集落形成试验观察miR-497对肝癌细胞增殖能力的影响，肝癌细胞周期和凋亡采用流式细胞仪检测，Western blotting法观察miR-497对肝癌细胞Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)表达的影响。结果 肝癌组织miR-497 表达水平显著低于癌旁组织(P<0.05)；癌细胞miR-497表达水平显著低于肝细胞(P<0.05)；miR-497过表达组在96 h和120 h肝癌细胞增殖能力显著低于对照组(P均<0.05)；对照组细胞增殖能力显著高于miR-497过表达组(P<0.05)；miR-497过表达组早期凋亡细胞数显著高于对照组(P<0.05)；对照组FADD相对表达量显著低于miR-497过表达组(P<0.05)。结论 miR-497可抑制肝癌细胞的增殖，促进凋亡，其作用可能与miR-497促进FADD表达有关。

肝肿瘤；微小RNA-497；细胞增殖；Fas相关死亡结构域蛋白

微小RNA(miRNA)是长度约为22 nt的非编码调控RNA，多数位于基因组中脆弱的位点或与肿瘤相关的区域，参与机体早期发育、细胞增殖、细胞分化及细胞凋亡等过程。针对miRNA与乙肝病毒、丙肝病毒患者相关性的研究日益增多[1]。miR-497位于17号染色体P13.1，与肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病关系密切[2,3]。在前期研究中发现，miR-497可表达于肝癌组织中。2014年1月～2016年1月我们进一步研究了miR-497对肝癌细胞增殖能力、凋亡的影响及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌细胞(HepG2)和人正常肝细胞系(L-02细胞)购买于复旦大学肝癌研究所，培养基为10%特级胎牛血清DMEM(高糖)，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。肝细胞癌组织标本来源于本院肝癌患者，均行肝癌根治术，术后经病理检查；癌旁组织取自距离肝肿瘤2 cm的组织。FBS胎牛血清(美国Gibco公司)，胰酶(美国Invitrogen公司)，EX Taq酶(日本Takara公司)，T4连接酶(日本Takara公司)，TRIzol(日本Takara公司)，细胞转染试剂 Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)。miRNA 提取试剂盒(美国 Ambion 公司)，Real-time Taqman 探针(美国APPLIED BIOSYSTEMS公司)，Taq Man 逆转录试剂盒(美国 APPLIED BIOSYSTEMS 公司)，四甲基偶氮唑蓝(MTT) (美国Amresco公司)，低熔点琼脂糖(宝泰克生物科技公司)。CO2培养箱(哈尔滨东联电子技术公司)，Nano Drop 2000C紫外可见分光光度计(美国Thermo Scientific公司)，Gene Amp 9700基因扩增仪(美国APPLIED BIOSYSTEMS公司)，iMark酶标仪(美国伯乐公司)，凝胶成像仪(美国KODAK公司)。

1.2 肝癌组织和癌旁组织、HepG2、L-02 miR-497表达检测 采用RT-PCR技术。组织样本经过液氮研磨，TRIzol法提取总RNA，分光光度计测定RNA质量(OD260/OD280)，琼脂糖凝胶电泳。HepG2和L-02接种于6孔板，待细胞汇合度达到90%～100%，TRIzol法提取总RNA，分光光度计测定RNA质量(OD260/OD280)。琼脂糖凝胶电泳，采用试剂盒步骤进行逆转录，Taqman探针法检测miR-497的表达。引物序列：上游引物5′-CGCCGCCCAGTGTTCAGA-3′，下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGG-3′;反应体系：taqman Universal Master Mix Ⅱ 5 μL，taqman assay 0.5 μL，cDNA 0.665 μL，Nuclease free water 3.835 μL。95 ℃ 10 min酶激活，95 ℃ 15 s变性，60 ℃ 15 s退火，72 ℃ 15 s延伸，40个循环。用2-△△Ct计算miR-497相对表达量。

1.3 细胞分组及转染 HepG2接种于24孔板中，待细胞培养至汇合率达到50%进行转染，1.25 μL 50 nmol miRNA mimics和阴性对照通过Lipofectamine2000(美国英潍捷基公司)进行转染，转染后24 h收集细胞进行实验。转染阴性细胞为对照组，转染阳性细胞为过表达组。

1.4 细胞增殖能力检测 转染后24 h，将细胞接种到 96孔板中，4×103/孔，每组6个复孔，分别在细胞生长24、48、72、96、120 h，加入20 μL MTT，震荡均匀，37 ℃孵育4 h，注射器小心吸取上清，加入150 μL DMSO，490 nm测定每孔吸光度。配置 1%的低熔点琼脂糖，加入等体积20% FBS和0.5%青霉素的DMEM，6孔板每孔加1.5 mL作为底层基质，细胞转染24 h后，调整至5×104/mL，100 μL细胞与琼脂糖混合作为上层基质，培养15 d，结晶紫染液进行染色，显微镜下观察结果并拍照。用Image Pro Plus6分析克隆大小和数目，统计直径大于50 μm的细胞克隆数目。

1.5 细胞周期和凋亡检测 转染后24 h，收集细胞，缓冲液清洗细胞3次，Annexin V和PI孵育染色。孵育20 min后，加入200 μL结合缓冲液，流式细胞仪检测细胞凋亡率。凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.6 肝癌细胞内Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)表达检测 采用Western blotting法。转染后24 h，收集细胞，裂解液裂解细胞，检测蛋白浓度，聚丙烯酰胺胶电泳，转移至备好的硝酸纤维素膜上(恒压100 V，50 min)，奶粉封闭，FADD抗体4 ℃过夜孵育，二抗孵育1 h，加入ECL，并进行显影观察。采用Image J软件进行蛋白相对量计算。

2 结果

2.1 组织和细胞中miR-497表达比较 肝癌组织、癌旁组织中miR-497 相比表达量分别为0.010±0.001、0.021±0.004，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。癌细胞、肝细胞中miR-497相对表达量分别为0.023±0.009、0.055±0.011，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 miR-497过表达对肝癌细胞增殖能力的影响 对照组和过表达组在接种后24、48、72 h肝癌细胞增殖能力均无统计学差异(P均>0.05)，过表达组在96 h和120 h肝癌细胞增殖能力显著低于对照组(P均< 0.05)。见表1。对照组细胞克隆数目达到(378.5±11.2)个，过表达组(154.7±15.3)个，对照组细胞克隆数目高于过表达组(P<0.05)。

表1 两组不同时间增殖能力比较(个

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.3 miR-497对细胞凋亡和细胞周期的影响 过表达组和对照组各细胞周期分布无统计学差异(P>0.05)；过表达组早期凋亡细胞数显著高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 miR-497对细胞凋亡和细胞周期的影响

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.4 miR-497对FADD表达的影响 对照组FADD相对表达量为0.54±0.24，过表达组FADD相对表达量为1.23±0.31，对照组FADD相对表达量低于抑制组(P<0.05)。

3 讨论

肝细胞癌是目前最为常见的实体恶性肿瘤之一，亚太地区和非洲地区为其高发地区，我国肝细胞癌发病人数占全球肝细胞癌发病人数的55%。肝癌在早期不易发现，患者发现时多为晚期，生存期一般只有3～16个月，确诊时病人常失去接受根治性治疗的机会。肝移植和手术切除可使肝细胞癌患者的五年生存率达到 70%。肝癌的危险因素众多，如丙肝病毒感染、营养缺乏、寄生虫感染和遗传等。miRNA在肝癌发病过程中作用尚不明确，但是miRNA参与了乙肝病毒感染过程，miRNA可通过RNA沉默调控乙肝病毒在体内的复制和机体免疫应答，从而导致了肝脏的正常生理活动的异常[4]。

miRNA是长度为20～25个的单链小分子 RNA，miRNA通过对基因编码的翻译进行控制，实现对调控基因表达功能的控制，miRNA调控作用可见于机体的生长发育、器官形成和细胞增殖等过程[5]。miRNA在肿瘤的发生发展中可能起到原癌或抑癌的作用。miRNA在多种肿瘤中表现出表达紊乱[5]，如食管癌、前列腺癌和甲状腺癌等。不同的miRNA在肿瘤细胞中表现出不同的行为模式，一般表达上调，一部分表达下调，上调的miRNA可促进癌症的发生发展，对抑癌基因、抑制细胞分化的基因和抑制细胞调亡的基因具有抑制作用，乳腺癌患者可表达20倍于正常人的miR-195，骨髓瘤中miR-155可促进肿瘤细胞的异常增殖[6]。表达下调的miRNA表现出抑癌基因作用，对于原癌基因具有沉默作用，miR-192可抑制人骨肉瘤细胞的抑制增殖，发挥抗癌功能[7]。

乙型肝炎感染是亚洲肝细胞癌的主要危险因素。乙型肝炎感染过程中，miRNA可调控病毒复制和机体免疫应答，不同种类的miRNA在乙型肝炎感染功能各有不同，比较转染HBV基因组HepG2 细胞与正常HepG2细胞，11种miRNA表达上调，7 种miRNA表达下调[8]。肝癌中也可检测到多种miRNA的表达异常，目前研究最为特异的为miR-122，miR-122 在几乎所有肝癌细胞系中表达下调，肝癌组织中miR-122也低于癌旁组织[9]。miR-21 在肝癌组织中比正常肝组织表达量高 10 倍，miR-21 能抑制 PTEN翻译，促进癌细胞增殖、转移[10]。本研究发现，肝癌组织miR-497表达低于癌旁组织，肝癌细胞中低于正常肝细胞，说明miR-497可能和肝癌的发生发展存在一定的关联。进一步研究中，通过转染在肝癌细胞中过表达miR-497，MTT实验和软琼脂集落形成实验均表明miR-497可抑制肝癌细胞的增殖，miR-497对癌细胞的细胞周期无影响，但可诱发其早期凋亡。miR-497是miR15家族中的一员，是一种高度保守的miRNA，miR-497与肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病存在密切关联。miR-497在乳腺癌中可使癌细胞细胞周期G1期受抑制。结肠直肠癌细胞中能抑制 IGF1-R3UTR的活性,下调IGF1-R。而在肾上腺皮质癌中，miR-497可促进癌细胞的凋亡[11]。细胞凋亡包含多种途径，而其中有多种蛋白参与其中，如Caspase系列蛋白、Bcl-2系列蛋白和 p53蛋白等[12]。Casapse在某些肿瘤的诱发和发展过程中扮演了重要的角色。凋亡因子FADD可通过调节Caspase蛋白表达诱导细胞的凋亡[13]。本研究结果显示过表达miR-497后，FADD表达显著上升，说明miR-497可通过某种机制上调FADD的表达，从而导致肝癌细胞的凋亡。

综上所述，miR-497可抑制肝癌细胞的增殖，促进凋亡，其作用可能与miR-497促进FADD表达有关。但其具体的作用机制，有待进一步的研究。

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张锐(E-mail：20131321@qq.com)

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2016-11-01)