脑卒中后抑郁大鼠额叶、海马、杏仁核神经元数量变化

李漾超，李云，李姝，杨宁

(1大理大学附属医院，云南大理671000 ；2大理大学临床医学院)

脑卒中后抑郁大鼠额叶、海马、杏仁核神经元数量变化

李漾超1，李云1，李姝，杨宁2

(1大理大学附属医院，云南大理671000 ；2大理大学临床医学院)

目的 观察脑卒中后抑郁(PSD)大鼠大脑情感障碍相关脑区额叶、海马、杏仁核神经元数量变化。方法 将20只健康成年雌性SD大鼠随机分为抑郁组、卒中组、PSD组和对照组，每组5只。抑郁组采用孤养法加以慢性不可预见的中等强度应激刺激(CUMS)制作抑郁模型。卒中组用线栓法建立脑卒中模型。PSD组先用线栓法建立脑卒中模型，然后用孤养法加以CUMS制作PSD模型。对照组大鼠正常饲养。给予CUMS后第29天处死各组大鼠，取额叶、海马、杏仁核区脑组织行神经元特异性核蛋白(NeuN)免疫荧光组织染色，光镜下计数并比较各组大鼠额叶、海马、杏仁核中神经元(NeuN阳性细胞)的数量。结果 PSD组大鼠情感障碍相关脑区额叶、海马、杏仁核中神经元数量分别为(98.20±1.78) 、(43.00±7.87) 、(93.00±3.53) 个/视野，均低于其他三组(P均<0.05) 。结论 PSD组大鼠情感障碍相关脑区额叶、海马和杏仁核神经元数量减少。

脑卒中后抑郁；额叶；海马；杏仁核；神经元；神经元特异性核蛋白

脑卒中是当今危害人类健康的最主要的疾病之一，具有高死亡率和高致残率的特点。抑郁症是脑卒中常见的并发症，常与卒中后残疾、认知障碍和较高的病死率相关。脑卒中后抑郁(PSD)表现为卒中后情绪低落、悲观厌世、烦躁、缺乏主动性、食欲不振、睡眠障碍及全身疲劳等症状。抑郁症并非完全是功能性的精神障碍，患者存在脑形态结构的改变，发生结构改变的部位可涉及额叶、颞叶以及与其相联系的纹状体、皮层和丘脑。边缘系统的海马和杏仁核参与了情感和行为的形成过程，与抑郁症关系密切。有研究发现PSD大鼠杏仁核神经元出现明显的凋亡现象[1]。提示PSD大鼠大脑情感障碍相关脑区神经元数量可能发生了变化，但尚未见相关文献报道。NeuN是神经元的一种敏感、特异的标记物，脑组织中的NeuN阳性染色细胞即为神经元[2]。本研究观察了PSD大鼠情感障碍相关脑区额叶、海马、杏仁核区神经元数量的变化，明确PSD大鼠情感相关脑区神经元存活情况。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 选择清洁级健康成年雌性SD大鼠20只，体质量200～250 g。大鼠由昆明医科大学动物实验中心提供，动物质量合格证号：SYXK(滇)2005-0004。实验过程中对动物处置符合大理大学实验动物处置的伦理学标准。小鼠抗神经核单克隆抗体(一抗)购自 Millipore公司；DylightTM488标记的羊抗小鼠IgG(二抗)购自KPL公司。

1.2 动物分组及处理 将20只大鼠按随机数字表法分为抑郁组、卒中组、PSD组、对照组，每组5只。卒中组采用线栓法[3]建立局灶性脑缺血模型，制备后置于同一笼内饲养，正常饮食、饮水。抑郁组每笼1只单独饲养，采用慢性不可预见的中等应激刺激(CUMS)结合孤养法建立慢性应激抑郁模型，共刺激28 d。PSD组：采用线栓法建立局灶性脑缺血模型，造模后每笼1只单独饲养，术后1周采用CUMS结合孤养方法建立PSD大鼠模型，共刺激28 d。正常组：大鼠置于同一笼内饲养，正常饮食、饮水。以上各组动物在相互隔离的环境下饲养，术后常规腹腔注射青霉素预防感染。各组均造模成功。

1.3 各组大鼠额叶、海马、杏仁核区神经元计数方法 采用NeuN免疫荧光组织染色法。各组大鼠CUMS第29天断头取脑，将脑组织放入4%多聚甲醛固定6 h。梯度酒精脱水后进行石蜡包埋、切片，冠状面上切取大脑额叶、海马、杏仁核，片厚5 μm，捞片后自然干燥，放入60 ℃烤箱烤2 h。二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，置于修复液中高压修复后自然冷却，依次用蒸馏水、PBS漂洗，封闭非特异性的抗原抗体反应1h后，加入1∶750稀释的一抗4 ℃过夜,PBST充分漂洗后加入1∶100的二抗，室温下孵育1h(严格避光)，PBS漂洗后50%甘油封片(严格避光)。荧光显微镜下观察。激发波长493 nm，发射波长518 nm，细胞核或细胞质内出现绿色荧光者为神经元细胞。每只大鼠每个脑区选择5张切片，每个切片选择5个非重叠视野(×400)，计数视野内神经元细胞数量。

2 结果

各组大鼠额叶、海马、杏仁核中神经元数量见表1。由表1可见，PSD组大鼠额叶、海马、杏仁核中神经元数量均低对照组、抑郁组和卒中组(P均<0.05)，抑郁组和卒中组大鼠额叶、海马、杏仁核中神经元数量均低于对照组(P均<0.05)。

表1 各组大鼠额叶、海马、杏仁核中神经元数比较

注:与对照组相比，☆P<0.05；与抑郁组相比，*P<0.05；与卒中组相比，#P<0.05。

3 讨论

NeuN是一种可溶解的核蛋白, 在体外可与DNA疏松的结合，同时NeuN也是脊椎动物神经系统大多数神经元胞核中的特异性蛋白质, 其只在成熟神经元细胞核中特异性表达，因此NeuN被作为脊椎动物成熟神经元的特异性标记物。NeuN能与脊椎动物神经系统中很多部位的成熟神经细胞核发生免疫反应, 包括脊髓、大脑皮质、海马、背侧丘脑、尾壳核、小脑等的神经元，主要参与调解神经元发育成熟的转录过程，而且仅仅在于神经元前体细胞迁移结束后才表达。NeuN检测神经元成熟比其他常用的神经元标记物更为敏感。

大脑皮质是机体的最高调节者，也是情感活动的最高调节者。前皮质尤其是额叶皮质与人的情绪、抽象思维和高级神经活动相关，是脑内重要的情感整合中枢。海马的功能是参与情绪的控制和反应，与情绪和认知关系密切；杏仁核是边缘系统的一部分，是产生情绪，识别情绪和调节情绪，控制学习和记忆的脑组织。研究表明，PSD患者存在海马及杏仁核容积异常缩小[3]。影像学研究结果也表明抑郁患者杏仁核容积明显小于对照组[4,5]。本研究结果发现PSD大鼠额前皮质、海马及杏仁核NeuN阳性细胞较其他对照组明显减少，提示PSD大鼠情感障碍相关脑区神经元细胞存活较少，神经细胞存在异常的死亡和丢失情况。

细胞凋亡是指为了维持内环境稳定，而形成的由基因控制的细胞自主的有序的死亡。正常情况下，细胞凋亡涉及一系列基因的激活、表达以及调控，细胞凋亡能使细胞更好的适应环境。但有研究发现脑缺血可以引起神经元的凋亡[6,7]，在中枢神经系统中，额叶、海马、杏仁核等部位对缺血极为敏感，缺血后神经元细胞极易出现凋亡、坏死。卒中导致神经元细胞凋亡、坏死的途径有：受体途径[8，9]、线粒体途径[10，11]及内质网应激[12]途径。缺血性脑卒中后，缺血、缺氧可导致神经元出现一系列异常变化，如细胞肿胀、细胞裂解、细胞器游离等，加速了神经元细胞的凋亡、坏死，进而形成脑组织不可逆性损伤，出现脑神经功能损害表现[13,14]。有研究发现PSD大鼠海马和杏仁核区域凋亡细胞增加[15，16]。本研究结果显现，脑卒中组、抑郁组及PSD组情感障碍相关脑区NeuN阳性细胞较正常对照组明显减少，而PSD组较各对照组明显减少，提示上述疾病状态均可导致细胞凋亡增加，细胞存活减少，这种改变在PSD病理过程中可能最为明显。

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国家自然科学基金资助项目(81360208)。

李云(E-mail： liyun_neuron@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.012

R749.1

A

1002-266X(2017)19-0043-03

2016-09-07)