FMNL2基因小干扰RNA 质粒转染人宫颈癌Hela、Siha细胞株Vimentin及E-cadherin的表达观察

陶明珠，张强，周铁军，杨成万

(西南医科大学附属医院，四川泸州 646000)

FMNL2基因小干扰RNA 质粒转染人宫颈癌Hela、Siha细胞株Vimentin及E-cadherin的表达观察

陶明珠，张强，周铁军，杨成万

(西南医科大学附属医院，四川泸州 646000)

目的 观察同源形成素样蛋白2(FMNL2)基因小干扰RNA 质粒转染人宫颈腺癌细胞株Hela、鳞癌细胞株Siha波形蛋白(Vimentin)及钙黏附蛋白E(E-cadherin)的表达的影响。方法 分别取Hela、Siha细胞各分为实验组、对照组，实验组中加入含有2 mL Lipofectamine 2000TM包裹的FMNL2-siRNA (100 nmol/L)的无血清培养基，对照组加2 mL的无血清培养基。采用RT-PCR法检测转染72 h时各组FMNL2、波形蛋白(Vimentin)及钙黏附蛋白E(E-cadherin) mRNA，采用细胞免疫化学染色法检测转染72 h时各组FMNL2、Vimentin及E-cadherin 蛋白。结果 转染72 h时Hela、Siha细胞实验组FMNL2 mRNA及蛋白的相对表达量均低于对照组，转染72 h时Hela、Siha细胞实验组Vimentin mRNA及蛋白的相对表达量均低于对照组，转染72 h时Hela、Siha细胞实验组 E-cadherin mRNA及蛋白的相对表达量mRNA相对表量均高于对照组(P均<0.05)。结论 FMNL2基因小干扰RNA 质粒转染可抑制Hela、Siha细胞Vimentin 表达，促进 E-cadherin表达。 FMNL2可能参与了宫颈癌EMT。

宫颈肿瘤；宫颈癌；宫颈鳞癌；宫颈腺癌；同源形成素样蛋白；上皮间质转化

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，组织学类型主要有鳞癌和腺癌，其侵袭和转移是影响患者预后的主要因素[1]。研究表明，在肿瘤侵袭和转移初始过程中，肿瘤上皮细胞可发生上皮间质转化(EMT)，抑制或逆转EMT可抑制肿瘤的侵袭和转移，EMT可增加肿瘤细胞的转移能力[2,3]。波形蛋白(Vimentin)、钙黏附蛋白E(E-cadherin)是EMT重要的相关蛋白。同源形成素样蛋白2(FMNL2)是一种新近发现的一种转移相关基因，位于2q23.3[4]。研究[5]发现，FMNL2可能通过EMT促进结直肠癌的浸润和转移。FMNL2在宫颈鳞癌组织中高表达，并且与淋巴结转移情况有关[6]，但FMNL2是否介导宫颈癌EMT的相关报道较少。我们观察了FMNL2基因小干扰RNA 质粒转染人宫颈腺癌细胞株Hela、鳞癌细胞株Siha Vimentin及E-cadherin表达的影响，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 人宫颈腺癌Hela细胞株由西南医科大学附属医院中心实验室惠赠,人宫颈鳞癌Siha细胞株购自南方医科大学病理学实验室。FMNL2抗体购自Chemcruz公司，E-cadherin、Vimentin抗体购自基因科技上海有限公司，Envision两步法试剂盒、DAB试剂盒、细胞打孔液Trion X-100购自中杉金桥公司。DMEM高糖型培养液购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司，胎牛血清(FBS)购自深圳赛泰克生物科技有限公司，二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司，胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液(PBS)购自上海生化公司。FMNL2-siRNA(可抑制FMNL2表达)转染试剂购自广州锐博生物科技有限公司；Lipofectamine 2000 Reagent购自lifetechnologies公司。总RNA提取试剂盒、DNA Marker、2×Taq PCR MasterMix购自北京天根科技有限公司，RT试剂盒购自成都博瑞克生物技术有限公司，PCR引物购自生工生物工程有限公司。CO2细胞电热恒温培养箱(HEPA class100型)购自美国Thermo公司，倒置相差显微镜(TS100-F100型)购自德国Leica公司，PCR扩增仪(TC-512型)购自英国Techne公司，凝胶扫描成像仪购自美国Bio-rad公司。

1.2 Hela、Siha细胞培养与FMNL2-siRNA转染方法 分别取Hela、Siha细胞，置于含10%FBS的DMEM培养基，37 ℃、饱和湿度、5% CO2恒温培养箱中培养。待细胞约80%融合时，0.25%胰蛋白酶消化，传代3次后备用。收集对数生长期的Hela、Siha细胞各分为实验组、对照组，1×105/mL 接种于6孔板中，每组3个复孔，37 ℃、饱和湿度、5% CO2培养箱中培养；待细胞融合达35%～50%时，吸弃上清液。向实验组中加入含有2 mL Lipofectamine 2000包裹的FMNL2-siRNA (100 nmol/L)的无血清培养基，对照组加2 mL的无血清培养基，培养72 h后备用。

1.3 各组FMNL2、Vimentin及E-cadherin mRNA检测 采用RT-PCR法。转染72 h,取对数生长期的各组细胞，常规TRIzol法提取总RNA，所有操作均严格按照总RNA提取试剂盒操作步骤于无菌条件下完成。配制逆转录反应体系，进行逆转录反应，将所得逆转录反应原液置于-20 ℃中保存；按PCR试剂盒说明书配制PCR扩增反应体系，进行PCR扩增反应，检测各组细胞FMNL2、Vimentin及E-cadherin mRNA，对PCR扩增反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，应用凝胶扫描成像系统检测电泳结果，以GADPH为内参，将目的基因与内参吸光值相比得到目的基因的相对表达量。GAPDH上游引物5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC -3′；下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA -3′，序列长度450 bp。FMNL2上游引物5′-TGGATTCGCAGCGAG-3′；下游引物5′-CAGGAGGTAGGTTCATAG-3′，序列长度120 bp。Vimentin上游引物5′-CGCTTCGCCAACACAT-3′；下游引物5′-AGGGCATCCACTTCACAG-3′，序列长度690 bp。E-cadherin上游引物5′-AAGCCTCAGGTC ATAAACATC-3′；下游引物5′-CGCCTCCTTCTTCATCATAG-3′，序列长度460 bp。反应条件：94 ℃、3min预变性，94℃、30 s变性，53 ℃、30 s退火，72 ℃、30 s延伸，30个循环；终末延伸，72 ℃，3 min；4 ℃保存备用。

1.4 各组FMNL2、Vimentin及E-cadherin 蛋白检测 采用细胞免疫化学染色法。取转染72 h时各组细胞，PBS缓冲液漂洗、室温下4%多聚甲醛固定15 min。滴加一抗FMNL2(稀释比例1∶50)、E-cadherin(稀释比例1∶100)、Vimentin(稀释比例1∶200)，室温孵育2 h，滴加A液，室温孵育30 min，滴加现配好的二氨基联苯胺(DAB)，显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。用Image-pro plus6.0图像分析软件分析，对每张爬片随机摄像5帧，检测其阳性细胞的平均光密度值(IOD)，取平均值。

2 结果

2.1 各组FMNL2、Vimentin及E-cadherin mRNA相对表达量比较 转染72 h时各组FMNL2、Vimentin及E-cadherin mRNA相对表达量比较见表1、图1。

表1 转染72 h时各组FMNL2、Vimentin及E-cadherin mRNA相对表达量比较

注：与同一细胞对照组比较，▲P<0.05；与Siha细胞对照组比较，#P<0.05。

图1 转染72 h时各组FMNL2、Vimentin及E-cadherin mRNA表达情况

2.2 各组FMNL2、Vimentin及E-cadherin 蛋白IOD值比较 转染72 h时各组FMNL2、Vimentin及E-cadherin蛋白IOD值比较见表2、图2、图3。

表2 转染72 h时各组FMNL2、Vimentin及E-cadherin蛋白IOD值比较

注：与同一细胞对照组比较，▲P<0.05；与Siha细胞对照组比较，#P<0.05。

注：a1 对照组FMNL2表达情况；a1′ 实验组FMNL2表达情况；b1对照组 Vimentin表达情况； b1′实验组Vimentin表达情况；c1对照组 E-cadherin表达情况；c1′ 实验组 E-cadherin表达情况。

图2 Hela细胞FMNL2、Vimentin及E-cadherin蛋白表达情况(×400)

注：a1 对照组FMNL2表达情况；a2实验组FMNL2表达情况；b1对照组 Vimentin表达情况； b2实验组Vimentin表达情况；c1对照组 E-cadherin表达情况；c2实验组 E-cadherin表达情况。

图3 Siha 细胞FMNL2、Vimentin及E-cadherin蛋白表达情况(×400)

3 讨论

EMT是一个极其复杂的过程，其特征是发生EMT的细胞上皮细胞特性逐渐消失，获得间质细胞特性，并伴有免疫表型的改变。上皮细胞标志物如Ecadherin表达减少， 间质细胞标志物如Vimentin 表达增高，是上皮间质转化的重要标志[7,8]。E-cadherin表达的下调或缺失是EMT的典型特征。 Vimentin即波形蛋白是一种中间丝蛋白，在上皮细胞中极少表达，是间质细胞一个重要的分子标记，其在上皮性肿瘤细胞表达阳性或增高就提示可能发生了EMT。EMT是肿瘤细胞获得侵袭和转移能力的最主要途径[9,10]。本实验发现Hela、Siha细胞均有Vimentin蛋白和mRNA的表达，且Hela细胞Vimentin蛋白和mRNA的相对表达量均高于E-cadherin蛋白和mRNA的相对表达量，同时也高于明显高于Siha细胞的Vimentin蛋白和mRNA的相对表达量。说明Hela细胞和Siha细胞均存在EMT，且Hela细胞的EMT程度更高。

FMNL2属于形成素同源蛋白家族，其主要功能为参与细胞骨架的构建及重塑，同时维持细胞的稳定结构和动态结构，与细胞分裂、变形等过程有关。其在恶性肿瘤中的研究较少，有研究表明FMNL2的表达与肝癌[11]、结直肠癌[12,13]、恶性黑色素瘤[14]、宫颈鳞癌[6]等的侵袭转移及预后有关。且有研究证实FMNL2在结直肠癌组织中可能通过促进结直肠癌EMT的发生，增强其侵袭、转移的能力[5]，但其在宫颈癌的浸润转移机制中是否与EMT有关尚不清楚。

本研究发现，转染72 h时Hela、Siha细胞实验组FMNL2、VimentinmRNA相对表量均低于对照组，E-cadherin mRNA相对表达量高于对照组。转染72 h时Hela、Siha细胞实验组FMNL2、Vimentin蛋白的IOD值均低于对照组，E-cadherin 的IOD值高于对照组。说明沉默FMNL2基因可在mRNA、蛋白水平抑制Hela细胞和Siha细胞的EMT。因此，FMNL2沉默能够抑制人子宫颈癌EMT的发生，从而发挥抑制子宫颈癌黏附、转移的作用。由此推测，FMNL2可能有促进宫颈癌细胞EMT的作用，其可能通过促进子宫颈癌细胞EMT从而促进宫颈癌细胞的黏附、转移。FMNL2对子宫颈癌细胞EMT影响机制，尤其是细胞传导信号通路的研究还有待于进一步实验验证和分析。EMT的发生涉及多个信号转导通路如TGF-β信号通路[15]、Wnt/β-catenin通路、Ras-MEK-MAPK通路、PI3K/Akt[16]、JAK/STAT3[17]通路等。FMNL2基因的编码产物属于DRFs家族成员，FMNL2是DRFs成员，序列里有GTP酶结合结构域和自身调节结构域，是Rho-GTP酶家族的下游效应因子，通过介导单细胞阿米巴样运动调控细胞移动[18]。其可以与肌动蛋白结合蛋白、Rho GTPase相互作用，是Rho信号转导通路、Scr酪氨酸激酶信号转导通路以及Wnt信号转导通路中的组成成分。FMNL2对子宫颈癌EMT的影响是否是通过上述转导通路发挥作用尚待进一步研究。

综上所述，FMNL2基因小干扰RNA 质粒转染可抑制人宫颈癌Hela、Siha细胞Vimentin 表达，促进细胞E-cadherin表达。 FMNL2可能参与了宫颈癌EMT。

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Expression of Vimentin and E-cadherin in human cervical carcinoma cell lines Hela and Siha transfected by FMNL2 gene siRNA

TAOMingzhu,ZHANGQiang,ZHOUTiejun,YANGChengwan

(TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

Objective To investigate the expression of Vimentin and E-cadherin in human cervical carcinoma cell lines Hela and Siha transfected with Formin-like protein 2(FMNL2)gene small interference RNA (siRNA). Methods Both Hela cells and Siha cells were divided into the experimental group and control group, respectively. Cells in the experimental group were treated with 2 mL serum-free culture medium containing 100 nmol/L FMNL2-siRNA encapsulated by Lipofectamine 2000TM. Cells in the control group were treated with 2 mL serum-free culture medium. We used RT-PCR to detect the expression of FMNL2, Vimentin and E-cadherin mRNA in each group 72 h after transfection. Cellular immunohistochemistry was applied to detect the expression of FMNL2, Vimentin and E-Cadherin proteins in each group 72 h after transfection. Results The relative expression of FMNL2 mRNA and protein in both Hela cells and Siha cells of the experimental group 72 h after transfection was lower than that in the control group, respectively (P<0.05). The relative expression of Vimentin mRNA and protein in both Hela cells and Siha cells of the experimental group 72 h after transfection was lower than that in the control group, respectively, whereas the expression of E-cadherin mRNA and protein was higher than that in the control group (allP<0.05).Conclusions FMNL2 gene small interference RNA transfection may inhibit the expression of Vimentin and promote the expression of E-cadherin in Hela cells and Siha cells. FMNL2 may participate in the epithelial-mesenchymal transition of human cervical cancer.

cervical neoplasms; cervical carcinoma; cervical squamous-cell carcinoma; uterine cervical adenocarcinoma; formin-like protein; epithelial-mesenchymal transition

四川省卫生厅科研基金资助项目(100243)。

陶明珠(1972-)，女，本科，主管护师，主要研究方向为肿瘤基础及护理。E-mail: ycwty163@163.com

杨成万(1969-)，男，硕士，教授，主要研究方向肿瘤病理。E-mail: ycwty@163.com。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.002

R737.3

A

1002-266X(2017)19-0005-04

2016-11-04)