细胞凋亡蛋白抑制因子2在乙型肝炎相关性肝癌患者中的表达意义

李林丰，崔丽娟，刘 智，夏 勤，秦海银，何 娇

(遂宁市中心医院病理科,四川遂宁 629000)

论著·临床研究

细胞凋亡蛋白抑制因子2在乙型肝炎相关性肝癌患者中的表达意义

李林丰，崔丽娟△，刘 智，夏 勤，秦海银，何 娇

(遂宁市中心医院病理科,四川遂宁 629000)

目的 研究细胞凋亡蛋白抑制因子2(cIAP2)在乙型肝炎(简称乙肝)和非乙肝相关性肝癌患者中表达的意义。方法 收集该院肝癌切除术患者的病例资料和组织标本，分别利用免疫组织化学和Western blot方法检测患者肝癌癌灶、癌旁和远癌旁肝组织的cIAP2蛋白表达情况。结果 在两组患者中肝癌癌灶、癌旁和远癌旁肝组织中，cIAP2的表达量依次下降。但是，在非乙肝相关性肝癌组中，远癌旁肝组织的cIAP2表达显著低于肝癌癌灶和癌旁，而在乙肝相关性肝癌组中，远癌旁肝组织的cIAP2表达量与癌旁的cIAP2表达量无明显差异，却低于癌灶的cIAP2表达量。结论 cIAP2是引起乙肝相关性肝癌发生的重要机制之一，可作为乙肝相关性肝癌患者抑制肝癌发展和清除乙肝病毒潜在的治疗靶点。

癌,肝细胞；肝炎病毒，乙型；细胞凋亡蛋白抑制因子2

乙型肝炎(简称乙肝)病毒(hepatitis B virus，HBV)是肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)发生的主要危险因素[1]。经手术治疗后的乙肝相关性肝细胞癌患者体内HBV仍持续复制，是肝癌治疗耐受的主要因素[2]。细胞凋亡蛋白抑制因子2(cellular inhibitor of apoptosis proteins 2，cIAP2)具有内源性抗细胞凋亡作用[3-4]。同时，cIAP2抑制剂能明显降低乙肝模型小鼠血清中的HBV DNA水平[5-6]。这表明，促进肝细胞的凋亡可以减少HBV的复制。而目前少见文献报道乙肝相关性肝细胞癌患者和非乙肝相关性肝细胞癌患者cIAP2的表达区别。因此，本研究通过比较乙肝和非乙肝相关性肝细胞癌患者癌灶组织内cIAP2的差异表达，为肝癌患者差异性治疗提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2014年5月到2015年5月内在本院进行肝癌切除的组织标本[包括肝癌癌灶、癌旁(癌灶边缘2 cm)和远癌旁肝组织中(癌灶边缘2～5 cm)]，乙肝和非乙肝相关性肝癌共23例。全部患者术前均是首次进行肝癌切除术，未进行放疗和化疗治疗。患者术前均进行完善的影像学和血清学检测，术后均进行病理学检查确认病灶为原发性肝细胞癌。肝癌病理诊断标准参照《原发性肝癌规范化病理诊断指南(2015版)》。本研究通过本院伦理委员会审批。最终，本研究总共纳入23例原发性肝癌患者，其中15例为乙肝相关性肝癌组，8例为非乙肝相关性肝癌组。

1.2 试剂 抗兔cIAP2抗体(ab32059)购自美国Abcam公司。抗兔β-actin抗体(BA2305)、山羊抗兔结合辣根过氧化物酶二抗(BA1055)、BCA蛋白质定量试剂盒(AR0146)和哺乳动物组织总蛋白提取试剂盒(AR0101)均购自武汉博士德生物公司。超敏型ECL检测试剂盒(KGP1126)购自南京凯基公司。免疫组化检测试剂盒(PV-9001/PV-9002)和DAB显色试剂盒(PV-9000)均购自北京中衫金桥公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化检测 肝癌癌灶、癌旁和远癌旁肝组织中用多聚甲醛常规固定48 h后，进行石蜡包埋，制作成3～5 μm石蜡切片。常规进行脱蜡至水后进行HE染色及免疫组化染色。免疫组化染色严格按照试剂盒说明书操作，即进行枸盐酸煮沸法抗原修复和3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶的活性后，

表1 患者一般情况的比较

5%牛血清蛋白封闭30 min，滴加抗兔cIAP2抗体(稀释比例1∶200)并4 ℃过夜，然后滴加二抗(1∶2 000)，最后再用DAB显色剂显色之后进行苏木素复染，透明、干燥、封片后显微镜下观察。染色结果用Image-Pro Plus 6.0(USA，Media Cybernetics)进行分析，每张片子取5个点，最终取平均值表示目的蛋白相对表达的水平。

1.3.2 Western blot检测 每100 mg的肝癌癌灶、癌旁和远癌旁肝组织中用哺乳动物组织总蛋白提取试剂盒提取组织总蛋白后，用BCA蛋白质定量试剂盒测定蛋白浓度。按每个样本50 μg的蛋白质上样，每孔均等质量等体积加入上样孔进行SDS-PAGE电泳：100 V恒压电泳90 min；湿转至PVDF膜中，5% 牛血清蛋白室温封闭90 min；加抗兔cIAP2抗体(1∶1 000)或抗兔β-actin抗体(1∶500)，4 ℃孵育过夜；洗涤后，加山羊抗兔结合辣根过氧化物酶二抗(1∶2 000)，室温孵育2 h。洗涤后，ECL试剂盒在化学发光成像系统发光检测。半定量分析：用Image Lab软件扫描已扣除背景的目的条带和相应组别的β-actin条带的灰度值，然后进行比较，所得的比值为目的蛋白的相对表达量。

2 结 果

2.1 患者一般情况及术后并发症 乙肝相关性肝细胞癌组中，12例最终病理诊断为高分化HCC，3例诊断为中低分化HCC；6例术后病理切片提示微血管侵犯。非乙肝相关性肝细胞癌组中，5例最终病理诊断为高分化HCC，3例诊断为中低分化HCC；2例病理切片提示微血管侵犯。两组患者除HBV DNA水平存在差异之外，其余一般情况差异均无统计学意义(表1)。两组患者均无手术相关死亡病例，其中6例患者出现手术相关严重并发症(26.09%)，肺炎3例(13.04%)，调整抗生素后痊愈；断面积液伴感染2例(8.70%)，行穿刺引流术后痊愈；胆漏1例(4.25%)，保守治疗后好转出院。

2.2 免疫组织化学和Western blot检测结果 免疫组化结果显示，在两组患者中肝癌癌灶、癌旁和远癌旁肝组织中，cIAP2的表达量依次下降。但是，在非乙肝相关性肝癌组中，远癌旁肝组织的cIAP2表达显著低于肝癌癌灶和癌旁(P<0.05)，而在乙肝相关性肝癌组中，远癌旁肝组织的cIAP2表达量与癌旁的cIAP2表达量无明显差异(P>0.05)，却低于癌灶的cIAP2表达量(P<0.05)，见图1。并且，在非乙肝相关性肝癌组中，远癌旁肝组织的cIAP2蛋白表达量显著低于乙肝相关性肝癌组远癌旁肝组织的cIAP2蛋白表达量(P<0.05)，而两组癌灶的cIAP2蛋白表达量无明显差异(P<0.05)，见图1。Western blot检测结果与免疫组织化学结果相似，见图2。

A：远癌旁肝组织;B：癌旁组织;C：肝癌癌灶;D：两组患者免疫组化的结果后得到的积分光密度累计值；1～3：非乙肝相关性肝癌组中远癌旁肝组织、癌旁组织和癌组织的cIAP2免疫组化染色的积分光密度累计值；4～6：乙肝相关性肝癌组中远癌旁肝组织、癌旁组织和癌组织的cIAP2免疫组化染色的积分光密度累计值。

图1 免疫组织化学检测组织内cIAP2的蛋白表达

A:Western blotting法检测分别检查非乙肝相关性肝癌组中远癌旁肝组织；癌旁组织和癌组织(1～3)和乙肝相关性肝癌组中远癌旁肝组织、癌旁组织和癌组织(4～6)的cIAP2蛋白表达；B：Image Lab软件分别检测非乙肝相关性肝癌组中远癌旁肝组织，癌旁组织和癌组织(1～3)和乙肝相关性肝癌组中远癌旁肝组织、癌旁组织和癌组织(4～6)的cIAP2蛋白印记的灰度值。

图2 Western blot检测组织内cIAP2的蛋白表达

2.3 相关性分析 对cIAP2在乙肝相关性和非乙肝性相关性肝癌癌灶、癌旁和远癌旁肝组织的表达量与术前临床指标进行相关性分析发现：乙肝相关性肝癌组中Western blot检测癌旁cIAP2水平与术前ALT水平呈负相关(r=-0.586，P=0.022)；非乙肝相关性肝癌组中免疫组化检测癌灶cIAP2水平与术前IGG15呈正相关(r=0.632，P=0.007)。其余指标与cIAP2水平无相关性，说明cIAP2与HBV载量可能是肝细胞向癌细胞恶变的主要因素之一。

3 讨 论

cIAPs家族包括cIAP1和cIAP2等，具有抑制细胞凋亡的作用[7]。目前已经在多种恶性肿瘤中发现cIAPs的高表达，cIAP1和cIAP2通过抵抗肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(TRAIL)的作用来抑制癌细胞的凋亡[8-9]。cIAP1和cIAP2还可以通过抑制caspase家族的活化抑制肿瘤细胞的凋亡[10]。Wu等[11]的研究认为，用cIAPs的拮抗剂作用于结肠癌细胞后可以观察到caspase-8激活并诱导肿瘤坏死因子α(TNF-α)的产生，继而促进肿瘤细胞的凋亡。Weber等[12]研究证实，用cIAPs的拮抗剂作用于黑色素瘤细胞后，可以观察到caspase-8和NF-κB的激活并促进细胞的凋亡。因此，cIAPs通过抑制caspase-8和NF-κB的表达促进肿瘤细胞的增殖。本次研究中，两组患者肝癌癌灶和癌旁都发现高水平的cIAP2的表达，这与先前报道的结果相类似。肝癌细胞由于基因组和遗传的不稳定性造成的无性增值的恶性组织，程序性凋亡被抑制，故而肝癌病灶中抑制肿瘤细胞凋亡蛋白cIAP2呈高表达。

本研究在癌灶组织中，乙肝相关性肝癌组的cIAP2蛋白表达量于非乙肝相关性肝癌组相比无明显差异，但是在远癌旁肝组织中，乙肝相关性肝癌组的cIAP2的表达量较非乙肝相关性肝癌组的远癌旁肝组织明显增高。这说明感染HBV和不曾感染HBV患者发病因素的不同也会影响肝癌的发展和进展，也说明cIAP2可能是HBV诱导肝癌发生的机制之一。Ebert等[5]研究表明cIAP2在HBV感染模型小鼠中下调TNF-α的表达，并抑制肝细胞的凋亡以及是导致抗病毒耐药的原因之一。在敲除cIAP1和cIAP2的小鼠中，HBV复制均被抑制，但是只有完全敲除cIAP2的小鼠中HBV复制才可能被明显抑制[5]。同时，有研究还发现用特异性cIAP2抑制剂作用于HBV感染小鼠时，肝内及血清中HBV表面抗原迅速下降，并且HBV核心抗原明显被抑制[6]，这说明抑制cIAP2的表达能清除体内HBV。因此，cIAP2是HBV感染促进正常肝组织向肝癌发展的重要机制之一，本研究中在远癌旁肝组织中，乙肝相关性肝癌组的cIAP2的表达量较非乙肝相关性肝癌组的远癌旁肝组织明显增高的结果也进一步证明了这一点。

综上所述，cIAP2诱导乙肝相关性肝癌发生和发展的重要机制之一。因此，cIAP2可作为乙肝相关性肝癌患者抑制肝癌发展和清除HBV的治疗潜在靶点。

[1]Chen W,Zheng R,Zhang S,et al.Annual report on status of cancer in China,2010[J].Chin J Cancer Res,2014,26(1):48-58.

[2]Benson AB,D′Angelica MI,Abrams TA,et al.Hepatobiliary cancers,version 2.2014[J].J Natl Compr Canc Netw,2014,12(8):1152-1182.

[3]Tian AP,Wilson GS,Lie S,et al.Synergistic effects of IAP inhibitor LCL161 and paclitaxel on hepatocellular carcinoma cells[J].Cancer Lett,2014,351(2):232-241.

[4]Finlay D,Vamos M,Gonzalez-Lopez MA,et al.Small-Molecule IAP antagonists sensitize cancer cells to TRAIL-Induced apoptosis:roles of XIAP and cIAPs[J].Mol Cancer Ther,2014,13(1):5-15.

[5]Ebert G,Preston S,Allison C,et al.Cellular inhibitor of apoptosis proteins prevent clearance of hepatitis B virus[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2015,112(18):5797-5802.

[6]Ebert G,Allison C,Preston S,et al.Eliminating hepatitis B by antagonizing cellular inhibitors of apoptosis[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2015,112(18):5803-5808.

[7]Dagenais M,Dupaul-Chicoine J,Champagne C,et al.A critical role for cellular inhibitor of protein 2 (cIAP2) in colitis-associated colorectal cancer and intestinal homeostasis mediated by the inflammasome and survival pathways[J].Mucosal Immunol,2016,9(1):146-158.

[8]Hashim YM,Vangveravong S,Sankpal NV,et al.The Targeted SMAC Mimetic SW Ⅳ-134 is a strong enhancer of standard chemotherapy in pancreatic cancer[J].J Exp Clin Cancer Res,2017,36(1):14.

[9]Philchenkov A,Miura K.The IAP protein family,SMAC mimetics and cancer treatment[J].Crit Rev Oncog,2016,21(3/4):185-202.

[10]Zappavigna S,Scuotto M,Cossu AM,et al.The 1,4 benzoquinone-featured 5-lipoxygenase inhibitor RF-Id induces apoptotic death through downregulation of IAPs in human glioblastoma cells[J].J Exp Clin Cancer Res,2016,35(1):167.

[11]WuP,ShiKJ,AnJJ,etal.TheLEF1/CYLDaxisandcIAPsregulateRIP1deubiquitinationandtrigger apoptosis in selenite-treated colorectal cancer cells[J].Cell Death Dis,2014,5:e1085.

[12]Weber A,Kirejczyk Z,Besch R,et al.Proapoptotic signalling through Toll-like receptor-3 involves TRIF-dependent activation of caspase-8 and is under the control of inhibitor of apoptosis proteins in melanoma cells[J].Cell Death Differ,2010,17(6):942-951.

Expression significance of cellular inhibitor of apoptosis proteins 2 in patients with hepatitis B related HCC

LiLinfeng,CuiLijuan△,LiuZhi,XiaQin,QinHaiyin,HeJiao

(DepartmentofPathology,SuiningMunicipalCentralHospital,Suining,Sichuan629000,China)

Objective To investigate the significance of cellular inhibitor of apoptosis proteins 2 (cIAP2) expression in the patients with hepatitis B and non- hepatitis B related hepatocellular carcinoma (HCC).Methods The medical record data and tissue samples in the patients with HCC resection operation were collected.Expression of cIAP2 in HCC cancer lesion,adjacent tissues and cancer-distant tissues was detected by immunohistochemical staining and Western blotting.Results In the cancer lesion,paracancerous tissues and cancer-distant tissues of the two groups,the cIAP2 expression amount was decreased in turn.But in the non-hepatitis B related HCC group,the cIAP2 expression in the cancer- distant tissues was significantly lower than that in the HCC cancer lesion and paracancerous tissues,while in the hepatitis B related HCC group,the cIAP2 expression amounts had no significant difference between the caner-distant tissues and paracancerous tissues,while lower than that in the cancer lesion.Conclusion cIAP2 is one of important mechanisms causing hepatic B related HCC and can serve as a therapeutic target point for inhibiting HCC development and eliminating hepatitis B virus.

carcinoma,hepatocellular;hepatitis virus,type B;cellular inhibitor of apoptosis proteins 2

李林丰(1982-)，主管技师，主要从事器官疾病病理诊断及肝脏疾病病理机制研究。△

，E-mail:llf0166@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.10.016

R735.7

A

1671-8348(2017)10-1349-03

2016-11-20

2017-01-31)