唑来膦酸对破骨细胞分化中CaMKⅡ δ及下游基因表达的影响*

王 会，刘娟娟，戚孟春△，董 伟，李 任，孙 红

(华北理工大学:1.口腔医学院口腔颌面外科教研室;2.基础医学院病理学教研室，河北唐山 063000)

论著·基础研究

唑来膦酸对破骨细胞分化中CaMKⅡ δ及下游基因表达的影响*

王 会1，刘娟娟1，戚孟春1△，董 伟1，李 任1，孙 红2

(华北理工大学:1.口腔医学院口腔颌面外科教研室;2.基础医学院病理学教研室，河北唐山 063000)

目的 研究唑来膦酸(ZOL)对破骨细胞分化中钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ δ(CaMKⅡδ)以及下游信号基因表达的影响。方法 将小鼠破骨前体细胞RAW264.7细胞分为对照组和ZOL组；两组细胞均用50 μg/L核因子κB受体激活蛋白配体(RANKL)诱导与第5天收获，ZOL组同时加用1×10-6mol/L ZOL处理2 d。5 d后收获细胞，检测破骨细胞生成及CaMKⅡ δ、活化T细胞核因子蛋白c1(NFATc1)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)及c-Src基因表达情况。结果 ZOL组TRAP+多核破骨细胞数目、牙本质吸收陷窝数目和面积分别是(20.0±3.2)、(18.0±4.2)和(6 335.3±1 043.2)μm2，显著低于对照组的(36.0±8.4)、(37.2±5.0)和(11 636.2±3 661.1)μm2(P<0.05或P<0.01)，分别下降了44.4%、51.6%和45.6%。ZOL处理还使破骨细胞分化中CaMKⅡδ及下游因子NFATc1、TRAP和c-Src 基因表达产生显著抑制，mRNA水平分别下降了44.1%、49.0%、53.8%和49.6%(P<0.05或P<0.01)，蛋白水平分别下降了43.5%、32.2%、45.5%和48.0%(P<0.05或P<0.01)。免疫荧光化学检测显示ZOL组CaMKⅡδ、NFATc1、TRAP和c-Src的荧光强度较对照组也明显减弱。结论 ZOL可显著抑制破骨细胞生成和骨吸收功能，并下调破骨细胞分化中CaMKⅡ δ及下游NFATc1、TRAP和c-Src基因表达。

破骨细胞；唑来膦酸；钙调蛋白依赖性激酶Ⅱδ；活化T细胞核因子c1；抗酒石酸酸性磷酸酶；c-Src

唑来磷酸(zoledronate，ZOL)能够显著抑制破骨细胞的生成及骨吸收功能，因而广泛应用于骨过度吸收性疾病[1]；但其作用机制尚未弄清。钙调蛋白(calmodulin)-活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells type c1，NFATc1)信号通路对破骨细胞的分化至关重要；而钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)是其中的关键信号分子[2-4]。CaMKⅡ有α、β、γ、δ 4个异构体[5]；国外学者研究显示，异构体δ对破骨细胞分化的调控作用可能最为关键[6-7]，但其是否参与ZOL诱发的破骨细胞抑制目前尚不清楚。本实验通过检测ZOL对CaMKⅡδ及其下游基因表达的影响，探讨CaMKⅡδ在ZOL诱发的破骨细胞抑制中的作用，为唑来膦酸治疗骨过度吸收性疾病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞株来自北京军事医学科学院；核因子-κB受体激活因子配体(RANKL)购自美国Biovision公司；DMEM培养基、唑来膦酸、胎牛血清购自中国四季青公司；兔抗鼠CaMKⅡ δ多克隆抗体、β-actin单克隆抗、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)单克隆抗体、NFATc1单克隆抗体、c-Src单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；TRAP染色试剂盒、异硫氰酸荧光素(FITC)、碘化丙啶(PI)购自美国Sigma公司；PCR引物购自上海生工；激光聚焦显微镜(LSCM)购自日本Olympus公司)；Rotor-Gene 3000荧光定量PCR仪购自美国gene company limited。

表1 Real-time PCR使用基因引物

1.2 方法 RAW264.7细胞分为对照组和ZOL组。两组细胞均用含50 μg/L RANKL的DMEM培养基培养5 d，使细胞向破骨细胞分化；ZOL组在RANKL诱导1 d后，加用1×10-6mol/L ZOL处理2 d[8]，继续培养。

1.2.1 破骨细胞生成及功能检测 (1)TRAP染色：细胞以5×103/cm2密度种在载玻片上制备细胞爬片。收获细胞后，按TRAP试剂盒说明进行染色，光镜200倍下选取6个视野，计数TRAP+多核细胞数目(细胞核大于或等于3个)，取平均值；每组检测3个细胞爬片[8]。(2)牙本质吸收陷窝检测：用新鲜拔除的下颌阻生智齿制备厚约0.2 mm的牙本质磨片，超声震荡，高温高压灭菌；细胞接种密度为5×103个/cm2。细胞收获后扫描电镜(Scanning Electron Microscope,SEM)观察，500倍下每个磨片上选取6个视野，测量吸收陷窝总数目及总面积，取平均值，作为该磨片的吸收陷窝数目及面积；每组检测3个牙本质磨片[8]。

1.2.2 CaMKⅡ δ及其下游因子NFATc1、TRAP、c-Src基因表达检测

1.2.2.1 免疫荧光细胞化学检测 以5×103个/cm2密度接种在激光共聚焦皿里。5 d后收获细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，0.4%的TritonX-100 PBS室温孵育25 min，单克隆抗体一抗4 ℃过夜，FITC标记为二抗，37 ℃避光孵育90 min，PI复染胞核，甘油封片，激光共聚焦显微镜(LSCM)观察，每个共聚焦小皿随机检测6个视野，实验重复3次。

1.2.2.2 Real-time PCR检测 Trizol法提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA；在Rotor-Gene3000荧光定量PCR仪上检测；引物见表1。反应条件为：95 ℃，30 s；95 ℃ 15 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，45个循环。计算目的基因mRNA相对表达量；每个因子设3个复孔。

1.2.2.3 Western blot检测 加蛋白酶抑制剂(RIPA)提取细胞总蛋白，Bradford法测蛋白浓度；加入1×buffer后，煮沸5 min变性；蛋白上样，凝胶电泳，转膜；室温封闭1 h，一抗4 ℃过夜，二抗37 ℃孵育35 min，ECL显色仪上显色。用Image-Lab分析软件检测膜上条带光密度值；实验重复3次。

2 结 果

2.1 ZOL对破骨细胞的生成和骨吸收功能影响 RANKL诱导5 d后，两组均出现TRAP+多核破骨细胞(细胞质红染)，见图1 ；与对照组比较，ZOL组多核破骨细胞显著减少，破骨细胞下降了44.4%(P<0.05)，见表2。扫描电镜(SEM)观察，两组牙本质磨片上均出现不同程度的吸收陷窝；ZOL组吸收陷窝的数目和面积均显著少于对照组(P<0.05或P<0.01)，见表2，分别下降了51.6%和45.6%。ZOL可显著抑制破骨细胞的骨吸收功能。

A:对照组TRAP染色；B：ZOL组TRAP染色；C:对照组牙本质吸收陷窝检测；D：ZOL组牙本质吸收陷窝检测。

图1 破骨细胞生成与功能

2.2 免疫荧光细胞化学检测CaMKⅡ δ、NFATc1、TRAP、c-Src表达 经检测，CaMKⅡ δ、NFATc1、TRAP、c-Src在两组细胞中均有表达；但在对照组中荧光较强；而在ZOL组中则表达明显较弱(图2，FITC标记靶蛋白，PI标记细胞核)。ZOL对破骨细胞分化中CaMKⅡ δ以及下游因子NFATc1、TRAP、c-Src蛋白表达均产生了显著的抑制作用。

2.3 Real-time PCR检测CaMKⅡ δ、NFATc1、TRAP、c-Src mRNA水平 经Real-time PCR分析，CaMKⅡ δ、NFATc1、TRAP、c-Src在两组中都有表达，但ZOL组mRNA水平明显下降。ZOL组CaMKⅡ δ、NFATc1、TRAP、c-Src mRNA水平分别为0.595±0.007、0.503±0.014、0.474±0.006和0.494±0.016，显著低于对照组的1.065±0.066、0.986±0.013、1.026±0.070和0.981±0.016(P<0.05或P<0.01)，较对照组分别下降了44.1%、49.0%、53.8%和49.6%。唑来膦酸显著下调了破骨细胞分化中CaMKⅡ δ及下游NFATc1、TRAP、c-Src mRNA水平。

表2 破骨细胞计数及牙本质磨片吸收陷窝定量分析

a:P<0.05,与对照组比较；b:P<0.01,与对照组比较。

图2 免疫荧光细胞化学检测CaMKⅡ δ及其下游基因在两组破骨细胞中表达(LSCM×400)

组别CaMKⅡδNFATc1TRAPc-Src对照组205.104±13.006243.283±10.200169.350±12.089223.276±11.830ZOL组115.921±5.891164.849±11.82592.322±8.307116.040±11.655t10.8188.6999.09611.183P<0.05<0.01<0.01<0.01

图3 Western blot检测两组中CaMKⅡ δ、NFATc1、TRAP、c-Src蛋白表达

2.4 Western blot检测CaMKⅡ δ、NFATc1、TRAP、c-Src蛋白表达 经Western-blot检测，ZOL组中CaMKⅡ δ、NFATc1、TRAP、c-Src的蛋白表达量较对照组明显减弱(图3)；定量数据分析显示(表3)，ZOL组中CaMKⅡ δ、NFATc1、TRAP和c-Src蛋白条带光密度值较对照组分别下降了43.5%、32.2%、45.5%和48.0%(P<0.01或P<0.05)。上述结果说明，ZOL能够显著降低CaMKⅡ δ、NFATc1、TRAP、c-Src蛋白表达，从而对破骨细胞的生成产生抑制作用。

3 讨 论

临床上牙周炎、骨肿瘤、种植体周围炎等疾病造成的骨过度吸收均与破骨细胞数目及活性异常有关[9]；ZOL作为临床上治疗骨过度吸收性疾病的常用药物，主要通过抑制破骨细胞分化及骨吸收功能发挥作用[1]。在本研究中，应用1×10-6mol/L ZOL处理RANKL诱导下的RAW264.7细胞48 h，发现TRAP+多核破骨细胞生成及骨吸收功能受到显著抑制，破骨细胞数及牙本质吸收陷窝显著少于未经处理的对照组；从而进一步证实了ZOL对破骨细胞的抑制功能。需要指出的是，ZOL加入的时间为RANKL诱导第2～3天，此时正是单核破骨细胞向多核破骨细胞融合，即细胞多核化阶段；因而上述结果证实，ZOL可在破骨细胞分化中期，即破骨细胞多核化阶段发挥对破骨细胞的抑制作用，从而影响破骨细胞的生成及后期的骨吸收功能。破骨细胞分化相关信号通路研究近年来取得了许多进展，其中NFATc1信号通路的发现被认为是一个重要突破[2-4]。在该信号通路中，CaMKs是Calmodulin下游Ca2+信号传递的重要分子；在CaMKs中，CaMK Ⅱ和CaMK Ⅳ在破骨细胞分化中的作用尤为重要。CaMK Ⅳ对破骨细胞分化的作用已证实[4]，而CaMK Ⅱ相关研究尚无明确定论。Park-Min等[10]发现， RANKL刺激可使破骨细胞分化中CaMK Ⅱ磷酸化；William等[11]研究显示，RANKL显著提高了破骨细胞中CaMKⅡ 的活性，提示CaMKⅡ 在破骨细胞分化中可能发挥着重要作用。本课题组前期研究发现，唑来膦酸可显著抑制破骨细胞分化中CaMKⅡ 和CaMK Ⅳ基因表达[8,12]，进一步说明了CaMKⅡ可能发挥的作用。

CaMKⅡ有ɑ、β、γ、δ四种异构体[5]；在破骨细胞分化过程中异构体ɑ、β表达较弱或几乎不表达，而异构体δ表达则较强[4,6-7]；提示CaMKⅡδ与破骨细胞分化密切相关；而CaMKⅡδ是否参与了ZOL对破骨细胞生成的抑制，目前尚不清楚。本研究发现，唑来膦酸处理可使破骨细胞分化中CaMKⅡ δ基因表达在mRNA及蛋白水平均显著下降，提示该因子可能参与了ZOL对破骨细胞分化的抑制。

NFATc1是破骨细胞分化的主要调节基因，参与Cathepsin K、TRAP、integrin β3、c-Src、DC-STAMP、Atp6v0d2等许多破骨细胞特异性基因表达的调控，对破骨细胞分化及骨吸收功能至关重要[2,13-14]。NFATc1基因敲除的胚胎干细胞不能向破骨细胞分化；而NFATc1过表达则在没有RANKL的条件下骨髓基质细胞依然能分化成破骨细胞[15]。本研究中，ZOL处理使破骨细胞分化中NFATc1、TRAP、c-Src蛋白及mRNA水平均较对照组显著降低；提示上述因子参与了ZOL对破骨细胞生成的抑制；鉴于NFATc1在破骨细胞分化中的作用，其表达下调可能是ZOL诱发的破骨细胞生成抑制的主要原因。

有关CaMKⅡδ调控NFATc1基因表达及破骨细胞分化的机制，目前尚不清楚。Chang等[6]研究认为，CaMKⅡ与CaMK Ⅳ一样[4]，通过cAMP response element (CRE)-binding protein(CREB)及c-fos信号通路来发挥作用；而Yao 等[7]则认为，CaMKⅡδ 具有拮抗CREB 信号通路的作用，因而支持Park-Min等[10]的研究结论，即CaMKⅡδ 通过MEK-ERK 信号通路来发挥对破骨细胞的调控作用。然而，CaMKⅡδ是怎样调控NFATc1基因表达及破骨细胞分化的？有哪些信号分参与其中，尚待进一步研究。

本研究表明，唑来膦酸可显著抑制破骨细胞生成及CaMKⅡδ、NFATc1、TRAP、c-Src基因表达；唑来膦酸对破骨细胞生成的抑制与上述因子表达下调有关。

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Effects of zoledronate on CaMKⅡ δ and down-stream gene expressions during osteoclast differentiation*

WangHui1,LiuJuanjuan1,QiMengchun1△,DongWei1,LiRen1,SunHong2

(1.TeachingandResearchingSectionofOralandMaxillofacialSurgery,CollegeofStomatology;2.TeachingandResearchingSectionofPathology,CollegeofBasicMedicine,North-ChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan,Hebei063000,China)

Objective To study the effect of zoledronate (ZOL) on Ca2+/calmodulin-dependent kinase Ⅱ δ (CaMKⅡδ) and down-stream gene expressions during osteoclast differentiation.Methods Mouse osteoclast precursors RAW264.7 cells were divided into the control group and ZOL group.The cells in both groups were induced with 50 μg/L receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL) and were harvested on 5 d,while the cells in ZOL group were also simultaneously treated with 1×10-6mol/L ZOL for 2 d.Five days later,the cells were harvested and examined osteoclastogenesis,as well as gene expressions of CaMKⅡδ,nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1 (NFATc1),tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and cell-sarcoma receptor coactivator (c-Src).Results The number of TRAP positive multinuclear osteoclasts,number and size of dentin absorption lacunae and area in the ZOL group were (20.0±3.2),(18.0±4.2) and (6 335.3±1 043.2)μm2respectively,which were significantly lower than (36.0±8.4),(37.2±5.0) and (11 636.2±3 661.1)μm2in the control group and decreased by 44.4%,51.6% and 45.6% respectively (P<0.01).ZOL also significantly inhibited the gene expressions of CaMKⅡ δ,NFATc1,TRAP and c-Src,and the mRNA levels of these genes were decreased by 44.1%,49.0%,53.8% and 49.6% respectively,the protein level were decreased by 43.5%,32.2%,45.5% and 48.0% respectively.The immunofluorescent cytochemistry detection results showed the fluorescence intensity of CaMKⅡδ,NFATc1,TRAP and c-Srcin in the ZOL group was significantly weakened when compared with the control group.Conclusion ZOL could significantly inhibit the osteoclast formation and bone absorption function,and down-regulates gene expressions of CaMKⅡ δ,NFATc1,TRAP and c-Src in osteoclast differentiation.

osteoclasts;zoledronic acid;Ca2+/calmodulin-dependent kinase Ⅱ δ;nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1;tartrate-resistant acid phosphatase;c-Src

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.10.004

国家自然科学基金资助项目(81270965)；河北省教育厅重点项目(ZD2015005)。 作者简介:王会(1983-)，硕士，主要从事唑来膦酸对破骨细胞分化中作用机制的研究。△

，E-mail:qimengchun@163.com。

R782

A

1671-8348(2017)10-1308-04

2016-10-28

2017-01-24)