酒石酸布托啡诺预处理对小鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制

刘锦源，司林杰

(1.南京医科大学第一附属医院 胸心外科，江苏 南京 210029；2.盐城市第一人民医院 重症医学科，江苏 盐城 224000)

·论 著·

酒石酸布托啡诺预处理对小鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制

刘锦源1，司林杰2

(1.南京医科大学第一附属医院 胸心外科，江苏 南京 210029；2.盐城市第一人民医院 重症医学科，江苏 盐城 224000)

目的：探讨酒石酸布托啡诺预处理对小鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。方法：取雄性C57BL/6小鼠30只，随机分为3组，每组10只。缺血再灌注组 (I/R组)结扎左冠状动脉前降支(LAD)30min，再灌注6h；布托啡诺预处理组(B+I/R组) 在缺血前30min经后肢肌肉注射酒石酸布托啡诺40μg·kg-1，余处理同I/R组；假手术组 (Sham组)开胸暴露心脏，仅LAD穿线但不结扎。Sham组和I/R组小鼠在缺血前30min肌肉注射等体积生理盐水。再灌注6h后，采集腹主动脉血样，酶联免疫吸附法测定血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌钙蛋白Ⅰ(CTnⅠ)的浓度；Western blot法测定心肌组织Cleaved caspase 8、Cleaved caspase 3、p-JNK和JNK的表达；凝胶电泳迁移率(EMSA)法测定心肌组织核因子-κB(NF-κB)结合活性。结果：与Sham组比较，I/R组血清CK-MB、CTnI和TNF-α水平显著升高 (均P<0.05)，心肌组织Cleaved caspase 8和Cleaved caspase 3蛋白表达水平、JNK磷酸化水平以及NF-κB结合活性显著升高 (均P<0.05)；与I/R组比较，B+I/R组血清CK-MB、CTnI和TNF-α水平显著下降 (均P<0.05)，心肌组织Cleaved caspase 8和Cleaved caspase 3蛋白表达、JNK磷酸化水平和NF-κB结合活性显著下降 (均P<0.05)。结论：酒石酸布托啡诺预处理对小鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用，可显著抑制I/R所致的炎症反应和心肌细胞凋亡，其机制与阻滞JNK/NF-κB信号通路相关。

酒石酸布托啡诺；心肌再灌注损伤；阿片受体；凋亡；小鼠

心肌缺血再灌注损伤是多种心血管疾病共同的病理生理过程，在这一过程中炎症因子和细胞凋亡起着重要作用[1]。研究表明，阿片受体激动剂吗啡可以减轻心肌缺血再灌注损伤[2]。酒石酸布托啡诺是一种新型的阿片受体激动-拮抗剂，主要激动κ受体，部分激动δ受体，对μ受体具有激动和拮抗双重作用，此外，还具有良好的镇痛、镇静作用，但是目前国内外关于布托啡诺对心肌缺血再灌注损伤的研究较少。因此，本研究拟通过建立小鼠心肌缺血再灌注损伤模型，探讨布托啡诺对心肌缺血再灌注损伤的影响及其作用机制。

1 材料和方法

1.1 主要药品及试剂

酒石酸布托啡诺注射液(江苏恒瑞医药有限公司)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)检测试剂盒、肌酸激酶同工酶(CK-MB)检测试剂盒和肌钙蛋白I(CTnI)检测试剂盒(南京建成生物工程公司)，Cleaved caspase 8、Cleaved caspase 3、p-JNK和JNK抗体以及NF-κB探针(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.2 实验分组与动物模型制备

取雄性C57BL/6小鼠30只，清洁级，体重20～25g，8～10周龄，由南京医科大学动物实验中心提供[合格证号：SCXK(苏)2002-0031]。小鼠腹腔注射5%戊巴比妥钠(40 mg·kg-1)麻醉，背位固定，行气管插管并连接动物呼吸机进行机械通气，呼吸频率130次·min-1，潮气量1～2ml。将30只小鼠随机分为3组，每组10只。于小鼠胸骨左缘第3～4肋间开胸，钝性分离肌肉及筋膜，暴露心脏。缺血再灌注组 (I/R组)在距左心耳下方约1mm处穿线(8-0 prolene丝线)结扎冠状动脉左前降支(LAD)，持续30min后松开，然后缺血心肌再灌注6h；假手术组 (Sham组) 开胸暴露心脏，LAD仅穿线但不结扎；布托啡诺预处理组 (B+I/R组)在缺血前30min经后肢肌肉注射布托啡诺40μg·kg-1，然后结扎LAD 30min，松开丝线再灌注6h。Sham组和I/R组小鼠在结扎LAD前30min肌肉注射等体积生理盐水。

1.3 血清指标测定

再灌注6h后，采集腹主动脉血样，4℃下以2500r·min-1离心15min，取上清液，置冰箱内-20℃保存待测，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清TNF-α、CK-MB、CTnI的浓度。

1.4 Western blot检测

再灌注6h采集血样后处死小鼠，留取左心室组织，置于液氮保存备用。心肌组织总蛋白按照相应蛋白提取试剂盒 (南京凯基生物公司)说明书进行提取，用BCA法对蛋白进行定量检测，30μg蛋白经电泳后，转膜并封闭1h，洗膜后加一抗Cleaved caspase 8、Cleaved caspase 3、p-JNK和JNK，4℃孵育过夜。洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下孵育1h。ECL化学发光显色，Bio-Rad图形分析处理系统扫描条带及灰度检测。

1.5 凝胶电泳迁移率检测(EMSA)

心肌组织核蛋白按照相应蛋白提取试剂盒 (南京凯基生物公司) 说明书进行提取，用BCA法对蛋白进行定量检测。细胞核蛋白、NF-κB探针以及EMSA结合缓冲液混匀后室温静置10min，行凝胶电泳及电转膜后行紫外交联，封闭液室温封闭15min，洗膜后采用核酸化学发光法显色NF-κB探针，Bio-Rad图形分析处理系统扫描条带及灰度检测。

1.6 统计学处理

2 结 果

与Sham组比较，I/R组血清CK-MB、CTnI和TNF-α水平显著升高 (均P<0.05)。与I/R组比较，B+I/R组血清CK-MB、CTnI和TNF-α水平显著下降 (均P<0.05)。见表1。

与Sham组比较，I/R组心肌组织Cleaved caspase 8和Cleaved caspase 3蛋白表达显著升高 (均P<0.05)。与I/R组比较，B+I/R组心肌组织Cleaved caspase 8和Cleaved caspase 3蛋白表达显著下降 (均P<0.05)。见图1。

组 别CK-MB/U·L-1CTnI/ng·ml-1TNF-α/ng·ml-1Sham组225±460.56±0.18183±34I/R组1109±87a2.33±0.61a796±91aB+I/R组563±49b0.98±0.24b334±65b

与Sham组比较，aP<0.05；与I/R组比较，bP<0.05

与Sham组比较，I/R组心肌组织JNK磷酸化水平和NF-κB结合活性显著升高 (均P<0.05)。与I/R组比较，B+I/R组心肌组织JNK磷酸化水平和NF-κB结合活性显著下降 (均P<0.05)。见图2、3。

3 讨 论

炎症反应和细胞凋亡是导致心肌缺血再灌注损伤的重要病理生理机制，可引起心室重构、心力衰竭和猝死等严重不良事件[3]。因此，如何减轻炎症反应、抑制心肌细胞凋亡进而保护心肌成为目前研究热点。

研究表明，阿片类物质可与心肌细胞κ受体和δ受体结合，发挥显著的心肌保护作用[4-5]。酒石酸布托啡诺是一种新型的阿片受体激动-拮抗剂，临床上广泛用于术后镇痛、分娩镇痛以及ICU患者镇痛[6]，但是国内外关于布托啡诺对心肌缺血再灌注损伤的研究较少。CTnI是特异性存在于心肌细胞中的重要调节蛋白，其对诊断心肌损伤具有高度的特异性和敏感性。CK-MB也是诊断心肌损伤的指标。本研究中我们发现，I/R组小鼠血清CTnI和CK-MB水平显著升高，表明心肌明显受损。布托啡诺预处理可以显著降低I/R组小鼠血清CTnI和CK-MB水平，表明布托啡诺具有心肌保护作用。

与Sham组比较，aP<0.05；与I/R组比较，bP<0.05

图1 各组小鼠心肌组织Cleaved caspase 8和Cleaved caspase 3蛋白的表达

Fig 1 The expression of Cleaved caspase 8 and Cleaved caspase 3 in mouse myocardium

与Sham组比较，aP<0.05；与I/R组比较，bP<0.05

图2 各组小鼠心肌组织p-JNK和JNK蛋白的表达。

Fig 2 The expression of p-JNK and JNK in mouse myocardium

与Sham组比较，aP<0.05；与I/R组比较，bP<0.05

图3 各组小鼠心肌组织NF-κB结合活性

Fig 3 The NF-κB binding activity in mouse myocardium

氨基末端激酶(JNK)是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的重要成员[7]。心肌缺血再灌注损伤时JNK磷酸化水平升高，激活血管内皮核转录因子-κB(NF-κB)，引起一系列炎症介质释放[8]。其中TNF-α可促进白细胞与内皮细胞的黏附并相互作用，使中性粒细胞向心肌缺血再灌注区域的浸润增加，导致炎症介质进一步释放，引起心肌损伤[9]。TNF-α既是一种重要的炎症因子，也是一种重要的死亡信号，可诱导心肌细胞凋亡。TNF-α可以在细胞表面与其受体结合，通过一系列信号转导，激活凋亡诱导蛋白Caspase 8，进一步活化Caspase 3，最终诱导心肌细胞凋亡[10]。本研究中我们发现，I/R组小鼠血清TNF-α水平显著升高，同时心肌组织中Cleaved caspase 8和Cleaved caspase 3蛋白表达明显增加，表明I/R小鼠存在明显的炎症反应和心肌细胞凋亡。布托啡诺预处理可以显著降低I/R小鼠血清TNF-α水平，抑制心肌组织中Cleaved caspase 8和Cleaved caspase 3的表达，提示布托啡诺预处理可通过抑制炎症反应和细胞凋亡发挥心肌保护作用。进一步研究显示，I/R组心肌组织JNK磷酸化水平和NF-κB结合活性显著升高，布托啡诺预处理显著降低I/R组心肌组织JNK磷酸化水平和NF-κB结合活性。提示布托啡诺通过与其受体结合，抑制JNK/NF-κB信号活化，减少炎症介质释放，抑制心肌细胞凋亡，从而减轻心肌缺血再灌注损伤。

综上所述，布托啡诺预处理对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用，可显著抑制I/R所致的炎症反应和心肌细胞凋亡，其机制与阻滞JNK/NF-κB信号通路相关。

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Effects of butorphanol pretreatment on myocardial ischemia-reperfusion injury and it′s mechanisms in mice

LIU Jin-yuan1，SI Lin-jie2

(1.DepartmentofThoracicandCardiovascularSurgery，theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity，Nanjing210029，China；2.DepartmentofIntensiveCareMedicine，theFirstPeople′sHospitalofYancheng，Yancheng224000，China)

Objective: To study the protective effects and it′s mechanisms of butorphanol on myocardial ischemia-reperfusion injury in mice.Methods:C57BL/6 mice were randomly divided into 3 groups (10 in each group).Myocardial I/R was induced by occlusion of left anterior descending (LAD) artery for 30min，followed by reperfusion for 6h in I/R and B+I/R groups.At 30min before ischemia，butorphanol 40μg·kg-1was injected via the hind limb muscle in group B+I/R.While the equal volume of normal saline was injected in group sham and I/R.Blood samples were taken from the abdominal aorta to determine the concentrations of serum TNF-α，CK-MB and CTnI by ELISA.The proteins expression of Cleaved caspase 8，Cleaved caspase 3，p-JNK and JNK were detected by Western blot.The NF-κB binding activity was detected by EMSA.Results：The levels of serum CK-MB，CTnI and TNF-α were significantly higher in group I/R than those in group sham(allP<0.05).The expression of Cleaved caspase 8，Cleaved caspase 3，p-JNK，and NF-κB binding activity were also significantly increased in group I/R(allP<0.05). The levels of serum CK-MB，CTnI and TNF-α in group B+I/R were significantly reduced(allP<0.05).The expression of Cleaved caspase 8，Cleaved caspase 3，p-JNK and NF-κB were also inhibited in group B+I/R(allP<0.05).Conclusion: Butorphanol pretreatment can protect the myocardium against I/R injury in mice.The protective mechanisms of butorphanol may be through inhibiting JNK/NF-κB signaling pathway.

butorphanol；myocardial reperfusion injury；opioid receptors；apoptosis；mice

2016-05-08

2016-09-03

刘锦源(1983-)，男，江苏建湖人，主治医师。E-mail：14118762@qq.com

司林杰 E-mail：silinjie001@163.com

刘锦源，司林杰.酒石酸布托啡诺预处理对小鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制[J].东南大学学报:医学版，2017，36(1)：74-77.

R452

A

1671-6264(2017)01-0074-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2017.01.018