长链非编码RNA CCAT1对前列腺癌PC-3细胞增殖、迁移及凋亡的影响

韩勖，凌志新，葛增乐，胡强，许斌，陈明

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009；2.东南大学附属中大医院 泌尿外科，江苏 南京 210009)

·论 著·

长链非编码RNA CCAT1对前列腺癌PC-3细胞增殖、迁移及凋亡的影响

韩勖1，凌志新1，葛增乐1，胡强1，许斌2，陈明2

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009；2.东南大学附属中大医院 泌尿外科，江苏 南京 210009)

目的：探讨长链非编码RNA结肠癌相关转录因子1(CCAT1)对前列腺癌PC-3细胞增殖、迁移及凋亡的影响。方法：采用荧光定量PCR检测CCAT1 siRNA在PC-3细胞中的敲低效率；通过CCK-8法、transwell迁移实验、流式细胞仪(FACS)检测低表达CCAT1对PC-3细胞增殖、迁移及凋亡的影响。结果：PC-3细胞转染CCAT1 siRNA后，qPCR检测细胞中CCAT1表达量明显降低；低表达CCAT1能显著抑制细胞增殖，减弱迁移能力，促进细胞凋亡。结论：CCAT1可能通过对细胞增殖、迁移及凋亡的调控促进前列腺癌发生、发展。

结肠癌相关转录因子1；前列腺癌；增殖；迁移；凋亡

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是泌尿系统常见的恶性肿瘤。在美国，前列腺癌已成为男性发病率最高的恶性肿瘤，2015年美国约有220 800新发病例，同时约有27 540人死于前列腺癌[1]。在欧洲，前列腺癌引发的死亡人数居男性肿瘤死亡人数的第3位[2]。2015年欧洲约有72 600人死于前列腺癌[3]。在中国，前列腺癌发病率略低于发达国家，据陈万青统计，我国每年前列腺癌新发病例数约5.7万，总发病率为8.14/10万，呈逐年上升趋势，且增长较发达国家更为迅速[4]。

长链非编码RNA(lncRNA)是一类转录本长度大于200 nt的ncRNA分子，通常由RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ)转录生成[5]。我们课题组在前期工作中发现，lncRNA结肠癌相关转录因子1(CCAT1)在前列腺癌组织中表达水平明显高于癌旁组织。本研究进一步明确CCAT1在前列腺癌PC-3细胞中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

人前列腺癌细胞株PC-3购自上海细胞库，CCAT1 siRNA及negative siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成，逆转录试剂盒(诺唯赞公司)，荧光定量PCR所需SYBR Green染料(Roche公司)，CCK-8试剂盒(凯基公司)，1640培养基、opti-MEM和胎牛血清(Gibco公司)，胰酶(Sigma公司)，LipofectamineTM2000、TRIzol (Invitrogen公司)，6、24、96孔细胞培养板、transwell小室(Corning公司)。

1.2 细胞培养与转染

在37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中用含1%双抗和10%胎牛血清的1640培养基培养PC-3细胞。当日用不含双抗的培养基将细胞接种于6孔板中，次日当细胞汇合度约60%时每孔加入500μl配制好的含有LipofectamineTM2000和siRNA的转染培养基opti-MEM(实验组和对照组细胞分别转染CCAT1 siRNA和negative siRNA)，水平十字晃匀，在培养箱中孵育6h后吸去旧培养基，每孔加入2ml完全培养基。CCAT1 siRNA序列：5′-UGUGGUAGGAAAGAGAAAUGAAUGG-3′；negative siRNA序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUG AAUGG-3′。

1.3 荧光定量PCR检测转染后PC-3细胞中CCAT1相对表达量

用TRIzol提取PC-3细胞的总mRNA，逆转录为cDNA，逆转录反应条件：25 ℃ 10min，50℃ 30min，85℃ 5min，用荧光定量PCR试剂盒进行检测。CCAT1上游引物：5′-GCCGTGTTAAGCATTGCGAA-3′，下游引物：5′-AGAGTAGTGCCTGGCCTAGA-3′；内参基因：GAPDH上游引物：5′-GAAATCCCATCACCACTTCCAGG-3′，下游引物：5′-GAGCCCCAGCCTTCTCCATG-3′。荧光定量PCR反应条件：95℃ 5min，95℃ 15s，60℃ 1min，40个循环。溶解曲线温度设定为60～95℃，每个样品设置3个复孔；应用2%琼脂糖凝胶电泳检测特异性。

1.4 CCK-8法检测细胞增殖

转染siRNA 48h后收集细胞，调整细胞悬液浓度铺至96孔板，细胞密度为3 000个·孔-1。实验组和对照组各设4行，每行设5个复孔，由当日开始加CCK-8试剂，每天两组各加1行，连续加4d。每孔加入10μlCCK-8试剂后，于培养箱中孵育2h后上机检测。在无细胞孔中加入完全培养基作为调零孔，在酶标仪上读数，吸收波长为450nm，绘制细胞生长曲线。

1.5 Transwell迁移实验检测细胞迁移

转染siRNA 48h后收集细胞，用无血清培养基重悬细胞，并调整悬液浓度为1×106个·ml-1。取100μl加入上室，下室所在24孔板每孔加入600μl完全培养基，培养箱中孵育8h，用PBS清洗transwell小室后放入24孔板，每孔加入 600μl 95%甲醇室温固定 20min。24孔板中每孔加入 600μl 0.2%结晶紫染液，室温染色20min。PBS轻洗后显微镜下计数穿过滤膜的细胞。小室的细胞数以显微镜下5个视野的细胞平均数为准。

1.6 流式细胞仪(FACS)检测细胞凋亡

转染siRNA 48h后收集细胞。用PBS轻洗细胞2次，加入500μl 1×binding buffer重悬细胞。细胞悬液中加入5μl Annexin V-FITC 试剂，混匀后室温避光孵育15min后加入10μl PI试剂，轻轻混匀，室温避光孵育5min，1h内送检。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 转染CCAT1 siRNA后PC-3细胞中CCAT1相对表达量

qPCR检测两组细胞中CCAT1相对表达量，每组设3个复孔，2—△△Ct为纵坐标。结果显示，实验组细胞中CCAT1表达水平较对照组明显降低(图1)，说明CCAT1 siRNA能够有效降低CCAT1表达量。

图1 qPCR检测细胞中CCAT1表达水平的敲低效果

2.2 转染CCAT1 siRNA对细胞增殖的影响

CCK-8法连续72h检测各组细胞的增殖能力，以时间为横轴、450nm吸光值为纵轴绘制生长曲线。结果显示，实验组吸光值较对照组明显降低(图2)，检测48、72h差异有统计学意义(P<0.05)，说明低表达CCAT1抑制细胞增殖。

图2 CCAT1敲低后实验组与对照组细胞增殖比较(aP<0.05)

2.3 转染CCAT1 siRNA对细胞迁移的影响

Transwell迁移实验结果显示，穿过滤膜的细胞数实验组较对照组明显减少(P<0.05，图3)，说明低表达CCAT1阻碍细胞迁移。

2.4 转染CCAT1 siRNA对细胞凋亡的影响

FACS检测细胞凋亡结果显示，总凋亡率实验组细胞较对照组明显增高(P<0.05，图4)，说明低表达CCAT1促进细胞凋亡。

A.迁移染色图；B.统计分析图

图3 CCAT1敲低后实验组与对照组细胞迁移比较(aP<0.05)

A.凋亡流式图；B.统计分析图

图4 CCAT1敲低后实验组与对照组细胞总凋亡率比较(aP<0.05)

3 讨 论

无论在欧美发达国家还是在中国，前列腺癌均已成为威胁男性健康的主要疾病之一。长链非编码RNA最初被认为是基因组的“转录噪音”，不具备生物学功能[6]。但最新研究[7-9]发现，IncRNA可从表观遗传、转录水平、转录后参与调控基因表达。

CCAT1是一个拥有2628nt的非编码RNA分子，最早在结肠癌中被发现，位于8q24.21、转录因子c-Myc附近，研究表明这是基因突变的高发区[10]。c-Myc可结合CCAT1上游的顺式作用元件E-box，从而促使CCAT1在细胞中高表达[11]；c-Myc还能够促进DNA合成与转录，加速细胞由G1期进入S期，促进细胞无限增殖，同时抑制细胞程序性死亡[12]。目前有关CCAT1与前列腺癌的相关性还未见报道。本实验通过siRNA敲低CCAT1表达后发现，前列腺癌PC-3细胞增殖及迁移受到明显抑制，细胞凋亡显著增加。我们猜想CCAT1可能通过对c-Myc的调控促进前列腺癌进展。而在本实验的基础上进一步探索CCAT1在前列腺癌中的分子作用机制，对于进一步揭示前列腺癌的发生发展具有重要意义。

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Effection of lncRNA CCAT1 on the proliferation，migration and apoptosis of prostate cancer cell PC-3

HAN Xu1，LING Zhi-xin1，GE Zeng-le1，HU Qiang1，XU Bin2，CHEN Ming2

(1.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China；2.DepartmentofUrologySurgery，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective:To explore the effect of IncRNA colon cancer associated transcript 1(CCAT1) on the proliferation，migration and apoptosis of prostate cancer PC-3 cells.Methods:qPCR assay was performed to confirm the low expression level of CCAT1 after the transfection of CCAT1 siRNA.CCK-8 assay，transwell migration assay and flow cytometry (FACS) were used to observe on its role in cell proliferation，migration and apoptosis.Results: The expression level of CCAT1 was efficiently knocked down with the transfection of CCAT1 siRNA.And knockdown CCAT1 could significantly suppress the ability of proliferation，migration and promote apoptosis.Conclusion:CCAT1 may promote the carcinogenesis of prostate cancer through regulation of cell proliferation，migration and apoptosis.

colon cancer associated transcript 1；prostate cancer；proliferation；migration；apoptosis

2016-08-05

2016-08-28

国家自然科学基金资助项目(81572517、81370849、81300472)

韩勖(1991-)，男，江苏南京人，在读硕士研究生。E-mail：hanxuseu@163.com

陈明 E-mail：mingchenseu@126.com

韩勖，凌志新，胡强，等.长链非编码RNA CCAT1对前列腺癌PC-3细胞增殖、迁移及凋亡的影响 [J].东南大学学报：医学版，2017，36(1)：1-4.

R737.25

A

1671-6264(2017)01-0001-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2016.01.001