血管活性肠肽对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠脑组织IFN-γ、IL-4因子含量的影响

杨元，陶涛，郭晓燕，袁正洲，吕志宇，李晓红，李作孝

(西南医科大学附属医院 神经内科，四川 泸州 646000)

·论 著·

血管活性肠肽对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠脑组织IFN-γ、IL-4因子含量的影响

杨元，陶涛，郭晓燕，袁正洲，吕志宇，李晓红，李作孝

(西南医科大学附属医院 神经内科，四川 泸州 646000)

目的：探讨血管活性肠肽(VIP)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠脑组织IFN-γ、IL-4含量的影响。方法：将60只健康雌性Wistar大鼠随机分成正常对照组，EAE对照组，VIP低剂量、高剂量干预组。利用髓鞘碱性蛋白(MBP)+完全福氏佐剂(CFA)建立EAE模型。自造模当日起，每隔1d分别对VIP低、高剂量干预组大鼠腹腔注射VIP 4nmol·kg-1(0.2ml)、16nmol·kg-1(0.8ml)，正常对照组及EAE对照组则给予生理盐水 0.8ml，连续10d。观察大鼠发病情况、脑组织中IFN-γ、IL-4因子含量及脑组织HE染色。结果：与EAE对照组比较，VIP各剂量干预组大鼠发病潜伏期延长、进展期时间缩短、发病高峰期神经功能障碍评分(NDS)降低；脑组织中IFN-γ含量降低、IL-4含量升高，且VIP高剂量干预组效果最明显；脑组织HE染色显示炎症细胞浸润程度下降。结论:VIP通过降低脑组织中IFN-γ、升高IL-4含量减轻脑组织炎症细胞浸润，发挥对EAE的免疫调节作用。

血管活性肠肽；实验性自身免疫性脑脊髓炎；IFN-γ；IL-4

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种中枢神经系统的自身免疫性疾病。Th1细胞免疫应答增强和Th2细胞免疫应答减弱是MS发病的重要机制[1]。由28个氨基酸残基组成的血管活性肠肽(VIP)是一种非胆碱能非肾上腺能神经递质。研究[2]表明，VIP通过与其受体结合，诱导免疫细胞增殖、分化、活化及迁移，促进Th2型抗炎因子(IL-4)的生成、抑制Th1型炎症因子(IFN-γ)的合成及分泌，从而发挥免疫调节的作用。国内外有将VIP用于自身免疫性疾病如类风湿关节炎(RA)的治疗报道[3]，但未阐明VIP在MS发病中对各种免疫细胞因子的具体作用。本实验探讨了VIP对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)大鼠脑组织IFN-γ、IL-4含量及脑组织炎症细胞浸润程度的影响，为临床应用VIP治疗MS提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要药物及试剂

健康雌性Wistar大鼠60只(200～250 g·只-1、6～8周龄)、健康豚鼠10只(250～300g·只-1)，均购于西南医科大学实验动物中心；VIP (北京博奥森生物公司产品)；完全弗氏佐剂CFA(美国Sigma公司产品)；IFN-γ ELISA、IL-4 ELISA免疫试剂盒(雅怡生物科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫抗原的制备 断颈处死10只豚鼠后，在无菌条件下迅速分离出脊髓，与等量的0℃生理盐水混合后研磨成50%的全脊髓匀浆(WSCH)。将CFA与WSCH等体积混合制备抗原。

1.2.2 实验动物分组、制模及药物干预 将60只雌性Wistar大鼠随机分为4组(每组15只)，将抗原注入EAE对照组，VIP低、高剂量干预组大鼠双侧后肢足掌皮下进行主动免疫，正常对照组给予等量生理盐水(NS)。自造模当日起，VIP低、高剂量干预组每隔1d分别腹腔注射VIP4nmol·kg-1(0.2ml)、16nmol·kg-1(0.8ml)，正常对照组及EAE对照组腹腔注射0.8mlNS，连续10d。

1.2.3 实验动物的动态观察 自造模日起，每日上午10时由同一观察者采用Kono′s评分标准对大鼠进行神经功能障碍评分(NDS)。

1.2.4 检测脑组织匀浆中IFN-γ、IL-4含量 采用双抗体夹心(ABC-ELISA)法检测脑组织匀浆中IFN-γ、IL-4含量。

1.2.5 检测脑组织中炎症细胞浸润情况 将大鼠脑组织行HE染色，观察CNS中炎症细胞浸润程度。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠的发病情况

正常对照组大鼠未发病。在免疫后第14～17天，除正常对照组外各组大鼠出现典型症状：双侧后肢无力拖地、行走画圈、爬行困难、精神极度衰弱、抽搐。大鼠发病潜伏期、进展期时间及高峰期NDS见表1。

2.2 各组大鼠脑组织中IFN-γ、IL-4含量变化

与正常对照组比较，EAE对照组，VIP低、高剂量干预组大鼠脑组织匀浆中IFN-γ水平升高、IL-4水平降低；与EAE对照组比较，VIP低、高剂量干预组大鼠脑组织匀浆中IFN-γ含量降低、IL-4含量升高，且高剂量组变化更明显。见表2。

2.3 各组大鼠脑组织病理变化

正常对照组大鼠脑组织中未见EAE基本病理改变；EAE对照组及VIP各剂量干预组大鼠脑组织则出现了不同程度的炎症细胞浸润：炎症细胞浸润在小血管周围，部分区域呈“袖套”状改变。见表3、图1。

组 别潜伏期/d进展期/dNDS/分EAE对照组 10.34±2.137.85±1.654.16±0.77VIP低剂量干预组14.17±1.67a6.20±1.97b3.75±0.98cVIP高剂量干预组20.73±1.98ad3.99±1.57ae2.59±0.58adF值37.4828.5418.95P值<0.01<0.05<0.01

与EAE对照组比较，aP<0.01，bP<0.05，cP>0.05；与VIP低剂量干预组比较，dP<0.01，eP<0.05

A.正常对照组；B.EAE对照组；C.VIP低剂量干预组；D.VIP高剂量干预组

组 别nIFN-γ/ng·ml-1IL-4/pg·ml-1正常对照组1511.21±0.8721.50±1.21EAE对照组1516.31±0.98a10.65±1.10aVIP低剂量干预组1513.84±0.80ab14.47±0.91acVIP高剂量干预组1512.90±0.76acd18.55±1.04aceF值88.1676.53P值<0.01<0.01

与正常对照组比较，aP<0.01；与EAE对照组比较，bP<0.05，cP<0.01；与VIP低剂量干预组比较，dP<0.05，eP<0.01

组 别nHE染色病理评分EAE对照组152.75±0.46VIP低剂量干预组152.05±0.56aVIP高剂量干预组150.84±0.51abF值21.38P值<0.01

与EAE对照组比较，aP<0.01；与VIP低剂量干预组比较，bP<0.01

2.4 相关性分析

Pearson 直线相关分析结果显示，各组发病大鼠神经功能障碍评分与脑组织匀浆中IFN-γ因子含量呈正相关(r=0.912，P<0.01)，与IL-4因子含量呈负相关(r=-0.940，P<0.01)。各组发病大鼠脑组织病理HE染色理评分与脑组织匀浆中IFN-γ因子含量呈正相关(r=0.896，P<0.01)，与IL-4含量呈负相关(r=-0.887，P<0.01)。

3 讨 论

作为Th1细胞分泌的特征性细胞因子，IFN-γ可促进Th0细胞向Th1细胞分化，增强Th1细胞免疫功能。相关体外研究[4]发现，VIP通过抑制树突状细胞(DC)产生IL-12、IFN-γ，诱导CD4+T细胞向Th2细胞分化，减少Th1细胞因子如IFN-γ的释放，使得初始T淋巴细胞优先向Th2型细胞分化。

本实验研究发现：EAE对照组，VIP低、高剂量干预组大鼠脑组织匀浆中IFN-γ的含量均较正常对照组明显升高(P<0.01、P<0.05)；发病大鼠脑组织匀浆中IFN-γ因子含量与大鼠发病高峰期NDS及脑组织病理变化呈正相关，表明在本实验过程中，Th1型细胞因子IFN-γ水平的升高促进了EAE疾病发生发展。同时本研究还发现：与EAE对照组比较，VIP低、高剂量干预组大鼠脑组织匀浆中IFN-γ含量明显下降，且高剂量干预组效果最明显。说明在EAE模型中，VIP可通过降低IFN-γ含量来抑制EAE的发病。

研究[5]表明，作为Th2细胞分泌的特征性因子IL-4，在EAE急性期明显低于正常水平，而在恢复期IL-4水平显著上升，IL-4通过正反馈机制增强Th2细胞功能、抑制Th1细胞活化、减轻炎性细胞因子产生，从而缓解EAE症状。本研究结果显示，EAE对照组，VIP低、高剂量干预组大鼠脑组织匀浆IL-4含量均较正常对照组明显降低；发病大鼠脑组织匀浆中IL-4因子含量与大鼠发病高峰期神经功能障碍评分及脑组织病理评分呈负相关，表明IL-4在EAE大鼠发病过程中具有保护作用。体外研究[6]发现，VIP上调未成熟DC细胞表面共刺激分子B7.2(CD86)，可刺激产生Th2细胞因子如IL-4。本实验发现：与EAE对照组比较，VIP低、高剂量干预组大鼠脑组织匀浆IL-4含量明显升高，且高剂量干预组效果最明显。表明在干预EAE进展时，VIP通过上调Th2细胞水平及其分泌IL-4功能，增强Th2细胞免疫，维持Th1/Th2免疫平衡，有效地缓解EAE疾病症状。

[1] JAGESSAR S A，HEIJMANS N，BLEZER E L，et al.Unravelling the T-cell-mediated autoimmune attack on CNS myelin in a new primate EAE model induced with MOG34-56 peptide in incomplete adjuvant[J].Eur J Immunol，2012，42(1):217-227.

[2] DELGODO M，ROBLEDO D，RUEDA B，et al.Genetic association of vasoctive intestinal peptide receptor with rheumatoid arthritis

[J].Arthritis Rheum，2008，58(4):1010-1019.

[3] JIMENO R，GOMARIZ RP，GARN M，et al.The pathogenic Th profile of human activated memory Th cells in early rheumatoid arthritis can be modulated by VIP[J].J Mol Med (Berl)，2015，93(4)：457-467.

[4] RAI PK，ZENG W，JACKSON DC，et al.Lipidated promiscuous peptide augments the expression of MHC-II molecules on dendritic cells and activates T cells[J].Indian J Med Res，2013，138(5):744-748.

[5] LUDVIKSSON B R，SEEGERS D，RESNICK A S，et al.The effect of TGF-betal on immune responses of naive versus memory CD4+ Thl/Th2 T cells[J].Eur J Immunol，2000，30(7)：2101-2111.

[6] DELGADO M，REDUTA A，SHARM A，et al.VIP/PACAP oppositely affects immature and mature dendritic cell expression of CD80/CD86 and the stimulatory activity for CD4(+) T cells[J].J Leukoc Biol，2004，75(6):1122-1130.

Effection of vasoactive intestinal peptide on content of IFN-γ，IL-4 in EAE rats′ brain tissue

YANG Yuan, TAO Tao, GUO Xiao-yan, YUAN Zheng-zhou, LÜ Zhi-yu,LI Xiao-hong, LI Zuo-xiao

(DepartmentofNeurology，AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity，Luzhou646000，China)

Objective:To explore the effects of vasoactive intestinal peptide (VIP) on the content of IFN-γ、IL-4 in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) rats′ brain tissue.Methods:Sixty healthy female Wistar rats were randomly divided into normal control group，EAE control group，VIP low-dose intervention group and VIP high-dose intervention group.Myelin basic protein (MBP) and completely adjuvant (CFA) were used to establish EAE model.Since building on，the low and high-dose VIP intervention groups were injected intraperitoneally with VIP 4nmol·kg-1(0.2ml)，16nmol·kg-1(0.8ml) every other day respectively，normal control group and EAE control group were with 0.8ml saline，10 days in a row.The incubation period，progression period and the neurological dysfunction score changes in peak of period rats were recorded，and the levels of IFN-γ，IL-4 and the pathological changes in brain were observed.Results:The incubation period was extended，the progression period was shortened，and nerve dysfunction score in peak period was decreased.The brain tissue levels of IFN-γ was reduced and IL-4 was increased in VIP intervention group，and this effect was the most obvious in high dose intervention group.The degree of infiltration of inflammatory cells in the VIP intervention groups were significantly lower than that in the EAE group.Conclusion: VIP can inhibits the infiltration of inflammatory cell by lowering the content of IFN-γ，up-regulating IL-4 the content of in brain tissue，and plays a role of immune regulation in EAE.

vasoactive intestinal peptide；experimental autoimmune encephalomyelitis；IFN-γ；IL-4

2016-04-29

2016-08-30

杨元(1988-)，女，四川达州人，住院医师。E-mail:lsh880801@163.com

李作孝 E-mail：lzx3235@sina.com

杨元，陶涛，郭晓燕，等.血管活性肠肽对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠脑组织IFN-γ、IL-4因子含量的影响[J].东南大学学报:医学版，2017，36(1)：67-70.

R741.05

A

1671-6264(2017)01-0067-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2017.01.016